Development of high-throughput epigenetic enzyme screening platform of reconstituted human chromatin in cell-free translation  Page description

Help  Print 
Back »

 

Details of project

 
Identifier
129083
Type NN
Principal investigator Nagy, Szilvia Krisztina
Title in Hungarian In vitro rekonstruált humán kromatin epigenetikus módosításának vizsgálatára alkalmas nagy áteresztőképességű módszer kifejlesztése
Title in English Development of high-throughput epigenetic enzyme screening platform of reconstituted human chromatin in cell-free translation
Keywords in Hungarian epigenetika, hiszton modifikáció, humán kromatin, sejtmentes transzláció, enzim assay
Keywords in English epigenetics, histone modification, human chromatin, cell-free translation, enzyme assay
Discipline
Molecular biology (Council of Medical and Biological Sciences)100 %
Ortelius classification: Molecular biology
Panel Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent Dept. of Molecular Biology (Semmelweis University)
Participants Mészáros, Tamás
Starting date 2018-12-01
Closing date 2022-11-30
Funding (in million HUF) 15.933
FTE (full time equivalent) 1.80
state closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

A jelen pályázat egy nagy áteresztőképességű kromatin és enzimvizsgálati módszer kifejlesztésére fókuszál, amely az epigenetikai módosítások in vitro vizsgálatát teszi lehetővé. Epigenetikus enzimfolyamatokat vizsgálunk, azaz epigenetikus ‘writers’ (arginin-metiltranszferázok, lizin-metil-transzferázok és acil-transzferázok, szerin/treonin/tirozin-kinázok) és ‘erasers’ (arginin-demetilázok, lizin-deacetilázok és demetilázok, foszfatázok) hatását a humán hiszton fehérjékre. Korábban kifejlesztett módszerünket alkalmazzuk a módosítatlan humán nukleoszómák rekonstruálására: a búzacsíra alapú, sejtmentes transzlációs módszerrel állítjuk elő a négy core-hisztont (H2A, H2B, H3, H4), majd enzimvizsgálatokat végzünk a szintén sejtmentes fehérje expresszióval termelt hiszton módosító enzimekkel. Célunk, hogy a mintákat a state-of-art Q-executive Orbitrap tömegspektrometriás készüléken elemezzük Dr. Takasuka segítségével és fenntartsuk hosszantartó, sikeres együttműködésünket. Kutatási célkitűzéseink:
- azonosított és feltételezett humán hiszton módosító enzimek kiválasztása, klónozása és expressziója,
- humán nukleoszómák rekonstrukciója és módosítása, hiszton módosító enzimek által történő, ismeretlen hiszton módosítások meghatározása tömegspektrometriával,
- új hiszton módosító enzimek (‘writers’ és ‘erasers’) meghatározása,
Eredményeinkkel hozzájárulunk a kifinomult epigenetikai hálózatok mélyebb megértéséhez és új humán terápiás módszerek feltárásához. A projekt eredményeit számos hazai és nemzetközi konferencián, nemzetközi folyóiratban tervezzük bemutatni és amennyiben lehetséges módszerünket szabadalmaztatjuk.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

Az epigenetika az elmúlt évtizedek egyik kiemelkedő tudományágává vált. Szerepe a humán egészségben, az öregedésben, a tumorok kialakulásában már bizonyított és az utóbbi időben a kromatin módosító enzimek potenciális gyógyszer célponttá váltak. A humán terápiában a hiszton-deacetilázok, -acetilázok, -metilázok és -demetilázok, valamint a DNS-metil-transzferázok inhibitorait sikeresen tesztelték leukémia, asztma, Alzheimer-kór, limfóma és más típusú rákos betegségek esetén. Az epigenetikai módosítások és az abban közreműködő fehérjék rendkívül bonyolult hálózatot alkotnak, az epigenetikai adatbázisokban igen nagy mennyiségű adat halmozódik fel, de a rendszer teljes megértése még várat magára. Kísérletinkben in vitro rekonstruált nukleoszómákat állítunk elő, enzimatikusan módosítjuk, majd tömegspektrometriával analizáljuk. Terveink közt szerepel, hogy létrehozzunk egy katalógust, mely tartalmazza a hiszton módosító enzimek újonnan feltárt vagy megerősített aktivitását és szubsztrát specifitását. Célunk egy új, univerzális és nagy áteresztőképességű módszer kidolgozása az in vitro kromatin módosítás vizsgálatára, amely segítséget nyújt a szakterület kutatóinak, hogy in vitro adatokat nyerjenek az in vivo megfigyelések kiegészítésére és lehetőséget kapjanak új potenciális gyógyszer célpontok felderítésre. A jövő kutatóinak meg kell találniuk a módját, hogy hogyan értelmezzék ezeket a hatalmas adatbázisokat, hogyan használják fel az humán egészség megőrzésére vagy helyreállítására, és hogyan tolmácsolják ezt a tudást a közönség számára.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

Az epigenetikus módosító enzimek napjaink potenciális gyógyszer célpontjai, ígéretes humán klinikai vizsgálatok folynak számos rosszindulatú daganatos betegséggel kapcsolatosan. A hiszton módosításokra kiterjedő ismereteinknek gátat szab, hogy nem rendelkezünk módosítatlan nukleoszomális szubsztrátok előállításához és vizsgálásához alkalmas módszerrel, mellyel az enzimaktivitások vizsgálhatók lennének. Dr. Takasuka-val folytatott tudományos együttműködésünk lehetővé teszi számunkra, hogy új, nagy áteresztőképességű, in vitro kromatinszerkezet vizsgáló és enzim screening módszert dolgozzunk ki az in vitro fehérjetermeléssel kapcsolatos tapasztalataink, valamint laborja csúcstechnológiás tömegspektrometriás készülékének segítségével. Ez az új platform univerzális vizsgálati eszközként szolgálhat a nukleoszomális hisztonok epigenetikai módosítására. A hiszton fehérjéket és hiszton módosító enzimeket sejtmentes transzlációs rendszerrel expresszáljuk, amellyel módosítatlan hisztonokat termelhetünk, ellentétben az in vivo mintákból kinyerhető módosított nukleoszómákkal. A ‘writer’ és ‘eraser’ enzimek által történő módosítások in vitro vizsgálhatóak lesznek akár több százas mintaszámmal, így segíteni fogják a kifinomult epigenetikai hálózatok mélyebb megértését, és új terápiás célokat tárhatnak fel a humán terápia számára.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.

A kromatin feladata, hogy a sejtmagban tárolja és védje a genetikai információt. Az utóbbi évtizedek egyik kiemelkedő tudományterületévé vált az epigenetika, mely a kromatint érintő, de a DNS szekvenciát nem befolyásoló, szerzett, és akár több generáción át öröklődő változásokkal foglalkozik. A humán kutatások bizonyítják a öregedésben és a rákos megbetegedésekben betöltött szerepét, így napjainkban az kromatint módosító enzimek potenciális gyógyszer célpontokká váltak. A rendszer rendkívül komplex és hatalmas mennyiségű kutatási adat halmozódik fel, viszont az eredmények teljeskörű magyarázata és a személyre szabott rákgyógyítás még várat magára. Az epigenetikus szabályozások központi egysége a nukleoszóma, amelyet nyolc darab fehérjére feltekert DNS szakasz alkot. Ezen molekulák felületén történő változások befolyásolják a fehérjék és a DNS közti kölcsönhatás erősségét, így a génekben tárolt információhoz való hozzáférést is, mely a szervezetben zajló biológiai folyamatok alapját képezi. Munkacsoportunk célul tűzte ki a nukleoszómák in vitro, azaz kémcsőben való előállítását, élő szervezet felhasználása nélkül. Az így előállított nukleoszómák felülete érintetlen, azaz a különböző módosító enzimek hatására végbemenő változások egyszerűen és pontosan azonosíthatók. A módszer lehetőséget nyújt az epigenetika területével foglalkozó kutatók számára, hogy különböző betegségekben szerepet játszó módosulásokat vizsgáljanak, a lehetséges gátlószereket (gyógyszereket) teszteljék. Módszerünkkel akár több száz enzim és gátlószer is vizsgálható egyszerre, így alkalmazása nagymértékben hozzájárulhat az egészség megőrzésével és helyreállításával kapcsolatos ismereteinkhez.
Summary
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

This proposal focuses on development of a high-throughput in vitro chromatin assembly and enzyme assay method that could serve as a universal investigation tool for epigenetic modifications. We investigate epigenetic processes, such as the effect of epigenetic writers (arginine methyltransferases, lysine methyltransferases and acyltransferases, serine/threonine/tyrosine kinases) and erasers (arginine demethylases, lysis deacetylases and demethylases, phosphatases) on human histone proteins. We utilize our currently developed methods to assemble unmodified, human nucleosome (composed of 4 core histones H2A, H2B, H3, H4) in wheat germ-based cell-free translation method as substrate, then perform enzyme assays with histone modifiers, also prepared by cell-free translation. We aim to analyze our samples with the state-of-art mass spectrometry methodology (Q-executive plus Orbitrap) with the help of Dr. Takasuka and maintain our fruitful collaboration. Our research plan consists of three aims:
- Selection, cloning and expression of reported and putative human histone modifying enzymes
- Assembly and modification of nucleosomes followed by determination of unknown histone modifications by histone modifying enzymes by mass spectrometry
- Determination of new histone modifiers (writers and erasers)
We help to reach deeper understanding of the sophisticated epigenetic networks and reveal new drug targets for human therapy. The outcome of the project will be introduced at several national and international conferences, published in international journals and potentially a patented method will be achieved.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

Epigenetics has become one of the outstanding disciplines of the last decades. Its role was demonstrated in human health, aging, tumors and recently chromatin modifying enzymes became a potential drug target. In human therapy, inhibitors of histone deacetylases, acetylases, methylases and demethylases, DNA methyltransferases are successfully tested on patients with leukemia, asthma, Alzheimer disease, lymphoma and different types of cancers. The contributing epigenetic pathways form an extremely complex system and large amounts of data are accumulated, but complete explanation can be expected in further future. Additionally, the reversible nature of epigenetic modifications could give a potential development of novel, personalized tumor therapies. We will produce, modify and analyze our in vitro reconstructed nucleosomes to create a catalogue for histone modification enzymes with newly discovered or verified activity and substrate specificities. We aim to set up a novel, straightforward and high-throughput method for analyzing chromatin modification in vitro which will help scientists to examine their topic of interest and gain in vitro data for complementing in vivo observations and search for new potential drug targets. As a future aim, scientists need to find the way how to interpret these large databases, how to use it for the sake of maintaining or restoring human health and how to interpret this knowledge for public audience.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

Epigenetic modifier enzymes are potential drug targets in human research and promising clinical trials are ongoing connected to various types of cancers. One of the limitation of the knowledge about histone modifications is the lack of methodology to produce and examine unmodified nucleosomal substrates for functional enzyme screening. Our scientific collaboration with Dr. Takasuka will give us the possibility to develop a novel, high-throughput in vitro chromatin assembly and enzyme assay method, by the usage of our experience in in vitro protein production and his state-of-art mass spectrometry methodology. This new platform could serve as a universal investigation tool for epigenetic modifications of nucleosomal histones. We will express histone proteins and histone modifiers with cell-free translation system, which provides unmodified histones, in contrast to modified nucleosomes extracted from in vivo samples. Then the modifications of writer and eraser enzymes can be tested on them in vitro in high-throughput way and will help to reach deeper understanding of the sophisticated epigenetic networks and reveal new drug targets for human therapy.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.

The role of chromatin is to store and protect the genetic information in the nucleus. Epigenetics has become one of the outstanding disciplines of recent decades, which means all the changes which is affecting the chromatin but not affecting DNA sequences, and it can be inherited through generations. Its role in aging and cancer was demonstrated, and recently chromatin modifying enzymes became a potential drug target. The system is extremely complex and huge amounts of data are accumulated, but complete explanation and personalized cancer treatment can be expected in further future. The central unit of the epigenetic processes is the nucleosome, formed by a DNA segment wrapped around eight proteins. Changes on the surface of these molecules influence the strength of the interaction between proteins and DNA, including the access to information stored in genes, which is the basis of biological processes in the cell. Our group aim to produce nucleosomes in vitro (in test tubes) without the use of living organisms. The surface of the these obtained nucleosomes is plain, i.e. the changes that occur due to the various modifying enzymes can be easily and precisely identified. The method allows researchers in the epigenetics field to investigate changes in various diseases, to test possible inhibitors (drugs). With our method, hundreds of enzymes and inhibitors can be tested simultaneously, so our research can greatly contribute to our knowledge of health preservation and restoration.





 

Final report

 
Results in Hungarian
Az epigenetika területén a mai napig nagy igény van olyan kromatinra, amely szubsztrátja lehet gyógyszerfejlesztési célú enzimmódosítási assay-eknek. Leírtunk egy többlépéses poszttranszlációs kromatin rekonstrukciós módszert, ahol a mag hisztonok és a kromatin összeállítási faktorok in vitro expressziója egyenként történik. Tömegspektrometriával igazoltuk, hogy a hisztonok mentesek a poszttranszlációs módosításoktól. A Mg(2+)-izolált kromatin stabil a fagyasztás-olvasztás ciklusok megismétlése után, hónapokig tárolható -80 °C-on, továbbá szubsztrátként szolgálhat hiszton módosítók számára. Kifejlesztettünk egy új, egylépéses in vitro koexpresszión alapuló kromatin összeállítási módszert is. A Drosophila és a humán kromatint is összeállítottuk a mag hisztonok és a kromatin összeállítási faktorok mRNS-einek, a cirkuláris plazmidnak és a topoizomeráz I-nek együttes hozzáadásával. A H1 linker hiszton sikeres asszociációja bizonyította, hogy a kromatin megfelelő szubsztrát. Az in vitro kromatin vizsgálatok változatosabb kísérleti összeállításának érdekében a pEU3 vektorcsaládot bővítettük. Az új His12 és FLAG affinitás címkét kódoló vektorok növelhetik az interakciós vizsgálatok specifitását, a Halo affinitás címke kovalensen kapcsolható ligandumot biztosít a pull-down vizsgálatokhoz, a dupla affinitás címkével (GST-His6 és GST-biotin) rendelkező vektorok pedig szélesítik a fehérje-fehérje interakciós vizsgálatok repertoárját.
Results in English
In the field of epigenetics, there is a great demand for reconstituted chromatin that can serve as a substrate for enzyme modification assays and drug development. Firstly, we described a multistep, posttranslational chromatin assembly method where the core histones and chromatin assembly factors are expressed in vitro, individually. Mass spectrometry proved, that the histones are free of posttranslational modifications. The Mg(2+)-isolated chromatin was shown to be stable over repeats of freeze-thawing cycles and can be stored over months at -80 °C. It can serve as a substrate for the in vitro-synthesized dGCN5 or dSet8 histone modifiers. Secondly, we developed a novel, single-step, in vitro coexpression-based chromatin assembly method. Both Drosophila and human chromatins were reconstituted by the combined addition of the mRNAs of core histones and chromatin assembly factors, circular plasmid, and topoisomerase I. Adding linker histone H1 affirmed that the chromatin is suitable for downstream applications. To achieve a more diverse experimental setup for the in vitro chromatin studies, the pEU3 vector family was expanded. His12 and FLAG affinity tag coding vectors can increase the specificity of interaction studies, Halo affinity tag vector provides covalently linkable ligands for pull-down assays, and double-tagging (GST-His6, and GST-biotin) vectors can broaden the possibilities of protein-protein interaction studies.
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=129083
Decision
Yes





 

List of publications

 
Petra Banko, Kei-ichi Okimune, Szilvia K. Nagy, Akinori Hamasaki, Ryo Morishita, Hitoshi Onouchi, Taichi E. Takasuka: In vitro co-expression chromatin assembly and remodeling platform for plant histone variants, SCIENTIFIC REPORTS 14: (1) 936, 2024
Petra Banko, Keiichi Okimune, Szilvia K. Nagy, Akinori Hamasaki, Ryo Morishita, Taichi E. Takasuka: In vitro chromatin assembly platform for Arabidopsis thaliana, The 44th Annual Meeting of Molecular Biology Society Japan, 2021
Endo Y., Takemori N., Nagy S.K., Okimune K.-I., Kamakaka R., Onouchi H., Takasuka T.E.: De novo reconstitution of chromatin using wheat germ cell-free protein synthesis, FEBS OPEN BIO, 2021
S.K. Nagy, P. Bankó, A. Tar, K. Bendali, T. Mészáros, T.E. Takasuka: Human chromatin reconstitution by cell­-free translation for epigenetic modifier enzyme assays, 45th FEBS Congress on 3–8 July 2021, 2021
Petra Banko, Keiichi Okimune, Szilvia K. Nagy, Taichi E. Takasuka: In vitro chromatin assembly platform for Arabidopsis thaliana, The 45th Annual Meeting of Molecular Biology Society Japan, 2022
Dr. Nagy Szilvia Krisztina: Development of an epigenetic enzyme screening platform of reconstituted human chromatin in cell-free translation, FEBS Advanced Courses, Chromatin Proteomics 22–27 September 2019, Heraklion, Greece, 2019
Dr. Nagy Szilvia Krisztina: Epigenetic enzyme screening assay with in vitro reconstituted human chromatin, The 9th Conference of the Serbian Biochemical Society: ‘Diversity in Biochemistry’ 14-16 November 2019, Belgrade, Serbia, 2019
Bankó Petra: Investigation of the role of human HDAC enzymes in histone modification, The 9th Conference of the Serbian Biochemical Society: ‘Diversity in Biochemistry’ 14-16 November 2019, Belgrade, Serbia, 2019
Yaeta Endo, Chiaki Hori, Szilvia K. Nagy, Nobuaki Takemori, Rohinton Kamakaka, and Taichi E. Takasuka: De novo reconstitution and isolation of chromatin using the wheat germ cell-free protein synthesis, Scientific Reports, 2020
Nagy Szilvia Krisztina, Kallai Brigitta Margit, Andras Judit, Meszaros Tamas: A novel family of expression vectors with multiple affinity tags for wheat germ cell-free protein expression, BMC BIOTECHNOLOGY 20: (1) 17, 2020
Okimune Kei-ichi, Nagy Szilvia K., Hataya Shogo, Endo Yaeta, Takasuka Taichi E.: Reconstitution of Drosophila and human chromatins by wheat germ cell-free co-expression system, BMC BIOTECHNOLOGY 20: (1) 62, 2020




Back »