Új MAP kináz szubsztrátok és interakciós partnerek azonosítása
Title in English
Identification and validation of novel MAP kinase substrates and interactors
Keywords in Hungarian
kináz, jelátvitel, fehérje-fehérje interakció
Keywords in English
kinase, signalling, protein-protein interaction,
Discipline
Molecular biology (Council of Medical and Biological Sciences)
50 %
Ortelius classification: Molecular biology
Signal transduction (Council of Medical and Biological Sciences)
50 %
Panel
Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent
Institute of Molecular Life Sciences (Research Center of Natural Sciences)
Starting date
2019-12-01
Closing date
2022-11-30
Funding (in million HUF)
25.500
FTE (full time equivalent)
2.40
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A mitogén aktiválta protein kinázok (MAPKok) általi foszforiláció nélkülözhetetlen mechanizmus a fehérjék funkciójának szabályozásához. A megváltozott MAPK jelátvitel számos tumorbiológiai, fejlődéstani és neurodegeneratív betegség patomechanizmusának alapja. Az eddig felhalmozott ismeretek ellenére azonban az egyes MAPKok eltérő szubsztrát felismerésének alapja nem ismert. Szubsztrátjaik jelentős része tartalmaz jól ismert lineáris dokkoló motívumot (D- és F-motívumok), melyek a MAPK ún. dokkoló árkába kötnek, azonban számos kísérletesen igazolt célfehérje esetében ilyen konszenzus szekvencia nem azonosítható. Mindez felveti annak kérdését, hogy ezen fehérjék esetében a felismerés hasonló módon történik-e, csak eddig nem azonosított motívumon keresztül, vagy e fehérjéket a MAPKok egy teljesen eltérő mechanizmussal képesek kötni, például adapter fehérjéken keresztül multimer komplexeket alkotva. Korábban elvégzett bioinformatikai és nagy áteresztőképességű vizsgálatokból szerzett adataink alapján, ilyen MAPK-adapter-szubsztrát trimer komplexek sejtbiológiai jelentőségét vizsgáljuk olyan fehérjék esetében, amelyek nem rendelkeznek dokkoló motívummal. Ezen túlmenően új interakciós partnerek azonosításán keresztül, a MAPKok proteomikai kapcsolatainak bővítését tűzzük ki célul. Funkcionális vizsgálatainkban kiemelten fokuszálunk azon feltételezett kapcsolatokra, amelyek a neuropatológiás jelentőséggel bírnak.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. E kutatási terv alapvető célja új MAPK szubsztrát felismerési mechanizmusok feltárása és funkcionális vizsgálata, valamint a MAPK fehérje-fehérje interakciós hálózat eddig nem ismert elemeinek azonosítása. A projekt keretében ~20 prediktált kináz-adapter-szubsztrát komplexet és ~50 új interakciós partner vizsgálunk sejtbiológiai és in vitro módszerek segítségével. Vizsgálni tervezem ezen interakciók sejtbiológiai jelentőségét a foszforilációs komplexek és új fehérje-fehérje interakciók célfehérjére gyakorolt hatásának és az ennek következtében végbemenő sejtbiológiai válaszok tanulmányozásával. A funkcionális vizsgálatok nagy mértékben függenek a pozitívan megerősített indirekt szubsztrátoktól és interakciós partnerektől, azonban figyelembe véve a nagyszámú prediktált fehérjét ismert neuromorfológiai és neuropatológiás jelentőséggel, ezen folyamatokkal összefüggésben a MAPKok által szabályozott fehérjékre kiemelt figyelmet fordítok. A javasolt kutatási terv alapján az indirekt szubsztrátok jobb megismerése a MAPK szignalizáció egy új mechanizmusára deríthet fényt. A javasol projekt neurobiológiai jelentőségű kináz-adapter-szubsztrát komplexek és MAPK interakciókon megerősítésén keresztül értékes adatokkal és új irányokkal szolgálhat az említett folyamatok későbbi sejtbiológiai és biokémiai vizsgálatához.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! Sejtbiológiai és in vitro technikák kombinálásával eredményeink olyan adapter fehérjéket fognak azonosítani, melyek megmagyarázhatják a kanonikus dokkoló motívumot nem tartalmazó, így közvetlenül MAPKhoz kötni nem képes szubsztrátok foszforilációját. Számos prediktált adapter több szubsztrát foszforilációjához is hozzájárulhat, mindez arra enged következtetni, hogy a MAPK-specifikus adapterek a komplex kialakulásában egyfajta szervező szerepet tölthetnek be. Az adapter funkció megértését célzó törekvésünket kiegészíti a MAPK interakciós hálózatának bővítése új MAPK fehérje-fehérje interakciók (FFI) azonosításán keresztül, amelyek potenciálisan a MAPK jelátvitel új szubsztrát, adapter és szabályozó fehérjéit tárhatják fel. Jelen kutatási terv alapját a metodikák nemzetközi szakértőivel kollaborációban elvégzett bioinformatikai és nagy áteresztőképességű kísérletes interakció vizsgálatok adják. Ezen eredmények alapján egyértelműnek tűnnek a közvetlen MAPK-szubsztrát páron alapuló modell korlátai, vagyis, hogy az számos esetben nem képes a MAPKok részvételét magyarázni, még a MAPKokra leginkább jellemző folyamatokban sem. Predikciós vizsgálataink rámutattak, hogy a MAPKok sok esetben egy adapter fehérjén keresztül komplexet alkotva indirekt módon képesek lehetnek kötni ezen szubsztrátjaikat. Korábban a neurobiológia területén szerzett kutatási tapasztalataimat kamatoztatva és azokra alapozva, kiemelt figyelmet tervezek fordítani az idegi fejlődésben és neurodegeneratív folyamotokban szerepet játszó indirekt szubsztrátokra és interakciós partnerekre. Az adapter fehérjék jelentős szerepét figyelembe véve a MAPK FFI-ban, eredményeim a MAPK jelátvitel egyes elemeinek specifikusabb célzását teszik lehetővé gyógyszerfejlesztési kutatások számára. A befogadó laboratórium kiemelt erőssége, hogy a kutatási terv kettős céljának végrehajtásához szükséges metodikai repertoárral már rendelkezik, vagyis korábban beállításra kerültek a fehérje interakciók biokémiai és szerkezeti megértéséhez, valamint azok funkcionális vizsgálatához szükséges technikai feltételek.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A fehérjemódosítások, amint a foszforiláció is, alapvető és rendkívül sokoldalú eszköztár a sejt számára információk fogadásra és feldolgozásra. A mitogén aktiválta protein kinázok (MAPKok) általi fehérje foszforiláció kiemelt jelentőséggel bír számos sejtfolyamatban, az osztódástól a differenciáción át egészen a sejthalálig. A MAPK jelétvitel jelentőségét jól mutatja, hogy rendellenes működésének jellemzően súlyos patológiai következményei vannak, amint az megfigyelhető a rák, fejlődéséi és idegi sejtpusztulásos betegségek esetében. Ezek ellen megfelelő terápiás eljárások kifejlesztéséhez elengedhetetlen a MAPKok szubsztrát felismerési mechanizmusainak és a MAPKok proteomban létesített kapcsolatainak precíz megismerése. Bioinformatikai predikcióink alapján jelen kutatási tervünk azokat a MAPK szubsztrátokat célozza, amelyek nem képesek a MAPK direkt kötésére, így foszforilációjuk megköveteli más (ún. adapter) fehérjék közreműködését, amelyek képesek a MAPKzal és szubsztrátjával egy komplexet kialakítani. Ezen túl célunk a MAPK interakciós hálózat jobb megértése új interakciós partnerek azonosításán keresztül. Vizsgálni kívánjuk az azonosított kapcsolatok sejtbiológiai jelentőségét, különös tekintettel a neurodegeneratív folyamatokban szerepet játszó fehérjékkel alkotott interakciókra. Így kiemelt figyelmet fordítunk azon fehérjékre, amelyek például az Alzheimer- és Parkinson-kór patomechanizmusában megfigyelhető toxikus fehérje aggregátumok kialakulásában kulcsszerepet játszanak.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. Phosphorylation by mitogen activated protein kinases (MAPKs) is an essential mechanism to control protein functions, clearly demonstrated by that altered MAPK signal transduction is a major contributor to the pathomechanism of oncogenesis, developmental and neurodegenerative disorders. Despite the accumulated information about MAPK target selection, the substrate-recognition of different MAPKs is still not understood. While a large subset of MAPK substrates contains well-characterized linear docking motifs (D- and F-sites) binding into so-called MAPK docking grooves, many experimentally validated MAPK targets lack these binding regions. This raises the question if these substrates apply a similar docking mechanism, but the required motif is yet to be identified, or the MAPKs have an alternative way of substrate binding mechanism, for example through the use of adapter proteins facilitating the formation of higher order complexes. Building on our dataset obtained by bioinformatic and high-throughput protein-protein interaction studies, we will assess the relevance and cellular importance of multimer MAPK-adapter-substrate complexes in which the target protein lacks a docking motif. We also aim to identify novel MAPK interactors revealing new connections of MAPKs in the proteome. Our functional studies will specially focus on candidate proteins having direct neuropathological relevance.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. The current research proposal targets the identification and functional assessment of novel mechanisms underlying MAPK-substrate recognition and new elements of MAPK based protein-protein interaction (PPI) network. The project aims to validate ~20 predicted kinase-adapter-substrate complexes and ~50 novel interactors combining cell culture and in vitro assays. I will also target the cellular importance of these interactions by investigating the impact of phosphorylation complexes and predicted PPIs on target protein function and downstream cellular responses. The functional studies are dependent on the positively validated candidates, however, considering the number of proteins with well-known function in neuronal cell morphology and neuropathology I will pay special attention to those MAPK controlled proteins that play a role in these processes. The proposed work will highlight the function of indirect substrates as a new concept in MAPK based signalling. By focusing the functional characterization of validated kinase-adapter-substrate complexes and MAPK interactions for those involved in neuronal development and pathomechanism, I can produce important results for biochemists and cell biologist alike with the resources and within the time frame of a PD proposal.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. By the application of combined cell-based and in vitro approaches our data will identify adapter proteins underlying the phosphorylation of MAPK targets lacking canonical mechanism for direct binding. Considering that several adapter candidates are predicted to facilitate the phosphorylation of multiple different substrates, we assume that MAPK-specific adapters possess an organizing role in complex formation. This effort is further supported by extending the MAPK interactome via the identification of novel MAPK interaction partners that could involve both substrates, adapters and upstream regulators of MAPK signalling. In our study large scale PPI bioinformatic data mining and high-throughput experimental PPI screening have been uniquely combined with the help of international experts. Based on these studies, it became clear that a direct, binary MAPK-substrate pair based hypothesis alone cannot explain many enigmatic functions of MAPKs. We revealed that MAPKs also form complexes with some of their substrates indirectly (i.e. through an adapter protein). In order to be competitive in this field and benefit from my former experience in neurobiology, I will specially focus on indirect substrates and interaction partners involved in neurodevelopmental and neurodegenerative processes. Considering the specific role of adapter complexes in MAPK based PPIs, my results may be helpful in enabling more specific targeting of MAPK related signalling activities for the pharmaceutical research. The host laboratory has the major advantage of having already established methodology to carry out the dual objectives of the proposal: understanding the biochemical/structural aspects of protein interactions and connecting these to functional analysis in cellular environment.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. Protein modifications, like phosphorylation, are fundamental and versatile tool for the cell to receive and process information. Protein phosphorylation by mitogen activated protein kinases (MAPKs) is involved in a large variety of cellular processes like cell proliferation, differentiation and cell death. The importance of MAPK signalisation is obvious as its malfunctions have serious pathological consequences demonstrated in cancer, developmental and neurodegenerative diseases. To design precise therapeutic strategies, the understanding of MAPK substrate recognition and how MAPKs are interconnected in the proteome are inevitable. Based on bioinformatic predictions the current research proposal targets those MAPK substrates that are unable to bind MAPK directly, therefore the phosphorylation of these proteins requires the contribution of other (adapter) proteins organizing MAPK and substrate proteins into a multimer complex. We also aim to identify novel interaction partners to extend MAPK based interaction networks. The cellular importance of the identified interactions will be investigated with special attention to neurodegenerative processes. Our work will focus on proteins involved in cytotoxic protein aggregate formation underlying the pathomechanism of Alzheimer and Parkinson diseases.
Final report
Results in Hungarian
A projekt a MAPK szignalizációs útvonalak által kiváltott genomi hatások jobb megértését célozta két megközelítést alkalmazva: új interakciós partnerek azonosításán és specifikus MAPK által kiváltott transzkripciós hatásokat vizsgálva. Ennek keretében új p38 célpontokat azonosítottunk, elsődlegesen citoszkeletális és neuronális jelentőséggel. Eredményeink rámutatnak az amiloid prekurzor fehérje (APP) JNK általi foszforilációjára, amely befolyásolhatja annak transzkripcionális hatásait a poszttranszlációs hasításának szabályozása által. Munkánk igazolta az IRS1 foszfoszerinjeinek szerepét a fehérje foszfotirozinjainak defoszforilációjában, amely potenciálisan receptor deszenzitizáció ellen hathat az inzulin jelátvitelben. RNAseq vizsgálatokban adott MAPKok genomi hatásait céloztuk genetikailag módosított sejtvonalak felhasználásával. Adataink szerint egyetlen MAPK aktiválása – mely hagyományos stimulánsokkal csak nehezen kivitelezhető – önmagában mérsékelt hatású, azonban kombinált MAPK aktiválás additív hatású. Mindez új megközelítésbe helyezi az egyedi MAPKok aktivációjának és hatásainak összeköttetéseit, amelyek a hatékony szignalizáció potenciális előfeltételei lehetnek. Kimutattuk továbbá, hogy egyetlen MAPK, nevezetesen JNK, jelentősen eltérő válaszok kiváltására képes a sejt eredetének függvényében, arra utalva, hogy a MAPK szignalizáció önmagában nehezen értelmezhető a sejtre specifikus transzkripcionális regulátorok megengedő hatásának figyelembevétele nélkül.
Results in English
We aimed the better understanding how MAPK signals transmitted toward the genome via extending MAPK signaling network from two directions: identifying novel interactors and by transcriptional responses evoked by specific MAPKs. We verified novel p38 targets primarily connected to cytoskeletal and neuronal regulation. Our data demonstrated the JNK phosphorylation of amyloid precursor protein (APP) can alter its role in transcriptional regulation via affecting its posttranslational processing. We proved the phosphoserine-dependent phosphotyrosine dephosphorylation of IRS1 protein which can counteract a potential receptor desensitization response in insulin signaling. In RNAseq studies we targeted MAPK-specific genomic actions applying genetically modified cell-lines for specific MAPK activation. We found that the activation of a single MAPK – that is usually not the case using agonists – results in a moderate response by the transcriptome however a combined induction has a surprising additive effect. It could be speculated whether the interconnected activation and downstream effects of different MAPKs are required for efficient signal transduction. We also revealed that the activation of a single MAPK, namely JNK, can result in fundamentally different responses based on cell origin indicating that MAPK signaling should be considered well-integrated within cell-specific transcriptional regulatory systems.
