KIS G-FEHÉRJE AKTIVÁLÓDÁS VIZSGÁLATA ANGIOTENZIN HATÁSMECHANIZMUSÁBAN
Title in English
SMALL G-PROTEIN ACTIVATION IN MECHANISM OF ACTION OF ANGIOTENSIN
Keywords in Hungarian
g-fehérje, angiotenzin II, FRET, BRET
Keywords in English
g-protein, angiotensin II, FRET, BRET
Discipline
Analysis, modelling and simulation of biological systems (Council of Medical and Biological Sciences)
50 %
Endocrinology (Council of Medical and Biological Sciences)
25 %
Cardiovascular system (Council of Medical and Biological Sciences)
25 %
Panel
Genetics, Genomics, Bioinformatics and Systems Biology
Department or equivalent
Dept. of Physiology (Semmelweis University)
Starting date
2006-02-01
Closing date
2009-01-31
Funding (in million HUF)
20.127
FTE (full time equivalent)
2.30
state
closed project
Summary in Hungarian
A kis G-fehérjék a különböző jelátviteli folyamatok központi szabályozó elemei és szinte minden sejtfunkcióban szerepet játszanak. A közelmúltban vált egyértelművé, hogy azon extracelluláris jelek, melyek G-fehérjéhez kapcsolt receptorokat aktiválnak a kis G-fehérjék aktiválódását is okozzák. Általánosan elfogadott tény, hogy a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok szignalizációjának elindítása a plazmamembránra korlátozódik. Napjainkban a különböző jelátviteli molekulák azonosítása intracelluláris kompartmentekben (pl. endoszómák) felveti a kérdést, vajon a receptorok reciklizációja során a sejten belül is elindulhatnak-e jelátviteli mechanizmusok. Kísérleteinkben arra keressük a választ, hogy (i) a heterotrimer G-fehérjéhez kapcsolt receptorok közé tartozó angitenzin-receptor agonista stimulációja, valamint reciklizációja során létrejön-e, illetve milyen módon (időben és térben) történik kis G-fehérje aktiválódás, illetve (ii) az angitenzin-receptor stimulációja után intracelluláris kompartmentekben történik-e kis G-fehérje aktiváció, mely az internalizálódott receptor szignalizációjára utal. Kísérleteinket korszerű molekuláris biológiai és detektálási módszerek alkalmazásával (FRET, BRET) végeznénk el. Kutatásaink gyakorlati haszna lenne, hogy az angiotenzin által okozott válaszok (pl. Rac aktiváción keresztül történő szuperoxid, illetve reaktív oxigén gyök képződés, vagy pl. a Rho aktiváción keresztül történő vazokontstriktor hatás) egy részéről pontosabb adatokat nyerhetünk.
Summary
The small G-proteins are central players of many signal transduction pathways and regulate a wide variety of cell functions. Recently discovered that extracellular stimuli of G-protein-coupled receptors (GPCRs) can lead to activation of various small G-proteins. It is generally accepted that the signal generation of GPCRs occurs at the plasma membrane. Demonstration of the presence of signaling molecules in intracellular compartments (endosomes) can raise the possibility if signal generation can occur during receptor internalization. The aims of this project are (i) to elucidate the dynamics of small G-protein activation upon stimulus and internalization of a GPCR (AT1 angiotensin receptor). (ii) To determine the role of small G-proteins in intracellular signal generation, if activation of AT1 receptors persists in endosomes. In this project we would like to combine molecular biological, biochemical, biophysical methods such as molecular engineering, FRET and BRET measurements. Our experiments can help in the better understanding of the widescale responses to angiotensin stimulus, such as generation of reactive oxygen species an superoxide via Rac activation and vasoconstricor effects via Rho activation.
Final report
Results in Hungarian
Az angiotenzin II 1-es típusú angiotenzin receptor (AT1R) közvetítésével kifejtett hatásainak egy részét kis G-fehérjék (Ras, Rho, Rac) aktiválásán keresztül hozza létre. Munkahipotézisünk szerint az AT1R az agonista stimulus hatására nemcsak a plazmamembránból, hanem az internalizálódott receptor intracelluláris kompartmentekből is képes jelátviteli folyamatokat aktiválni kis G-fehérjéken keresztül.
Kísérleteinkhez a kis G-fehérje aktiválódás kimutatására intra- és intermolekuláris szondákat készítettünk, melyeket különböző intracelluláris kompartmentekhez irányítottunk. Ezen szondák felhasználásával vizsgáltunk kis G-fehérje (Ras, illetve Rho) aktiválódást biolumineszcencia rezonancia energiatranszfer (BRET) módszerrel. A BRET méréssel kapott eredményeinket egyedi sejteken, fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer (FRET) mikroszkópos mérésekkel is megerősítettük.
Ezen szondák segítségével sikerült nemcsak a plazmamembránon, de a sejten belül is kis G-fehérje aktiválódást kimutatnunk a transz-Golgin és a mitokondriumok külső membránján. Vad típusú, illetve mutáns AT1-R-ok koexpressziójával készült vizsgálataink szerint a Golgin kapott aktiválódás a plazmamembránnal áll kapcsolatban, míg a mitokondriumok esetében az internalizált receptorok hozták létre a hatást. Eredményeink szerint ezen bioszenszorok alkalmasak növekedési faktorok, hormonok szignalizációjának vizsgálatára, valamint különböző sejtkompartmentekben vizsgálhatjuk kis G-fehérje jelpályák működését.
Results in English
Recently discovered that AngII stimulus of AT1 angiotensin receptor can lead to activation of various small G-proteins including Ras, Rho and Rac. It is well known that the signal generation of GPCRs occurs at the plasma membrane. Demonstration of the presence of signaling molecules in intracellular compartments can raise the possibility if signal generation can occur from intracellular compartments.
In this project we have investigated the dynamics of small G-protein activation upon stimulus and internalization of AT1-R utilizing numerous intra- and intermolecular probes in bioluminescence resonance energy transfer (BRET), fluorescence RET (FRET) imaging measurements in living cell experiments. In order to investigate small G-protein activation in different plasma membrane and intracellular compartments we targeted our probes to various cellular locations such as endosomes, endoplasmic reticulum, Golgi etc.
Comparing the data which were obtained utilizing either wild type or a non-internalizable AT1 receptors co-expressed with the fluorescent probes HEK293 cells revealed small G-protein activation starting not only from plasma membrane and but from intracellular compartments such as trans-Golgi and mitochondria in response to AngII stimulus.
These studies provided valuable information about the the widescale responses to angiotensin stimulus through small G-protein activation and we have demonstrated small G-protein activation starting from intracellular locations.
Balla A, Tuymetova G, Toth B, Szentpetery Z, Zhao X, Knight ZA, Shokat KM, Steinbach PJ and Balla T: DESIGN OF DRUG-RESISTANT ALLELES OF TYPE-III PHOSPHATIDYLINOSITOL 4-KINASES USING MUTAGENESIS AND MOLECULAR MODELING., Biochemistry, 2008 Feb 12;47(6):1599-607., 2008, 2008
Balla A, Kim YJ, Varnai P, Szentpetery Z, Knight ZA, Shokat KM and Balla T: MAINTENANCE OF HORMONE SENSITIVE PHOSPHOINOSITIDE POOLS IN THE PLASMA MEMBRANE REQUIRES PHOSPHATIDYLINOSITOL 4-KINASE III ALPHA, Mol Biol Cell. 2008 Feb;19(2):711-21., 2007, 2008
Balla A and Balla T: Phosphatidylinositol 4-kinases: old enzymes with emerging functions., Trends Cell Biol. 16(7):351-61, 2006, 2006
Knight ZA, Gonzalez B, Feldman ME, Zunder ER, Goldenberg DD, Williams O, Loewith R, Stokoe D, Balla A, Toth B, Balla T, Weiss WA, Williams RL and Shokat KM: A pharmacological map of the PI3-K family defines a role for p110alpha in insulin signaling., Cell. 125(4):733-47, 2006, 2006
Knight ZA, Feldman ME, Balla A, Balla T, Shokat KM.: A membrane capture assay for lipid kinase activity., Nature Protocols 2007;2(10):2459-66., 2007
Toth B, Balla A, Ma H, Knight ZA, Shokat KM and Balla T: Phosphatidylinositol 4-kinase IIIbeta regulates the transport of ceramide between the endoplasmic reticulum and Golgi, J Biol Chem. 281(47):36369-77, 2006, 2006
Lukacs V, Thyagarajan B, Varnai P, Balla A, Balla T, Rohacs T.: Dual regulation of TRPV1 by phosphoinositides, J Neurosci. 2007 Jun 27;27(26):7070-80, 2007
Kakuk A, Friedlander E, Vereb G Jr, Kasa A, Balla A, Balla T, Heilmeyer LM Jr, Gergely P and Vereb G.: Nucleolar localization of phosphatidylinositol 4-kinase PI4K230 in various mammalian cells., Cytometry A. 69(12):1174-83, 2006, 2006
