Determination of substrate binding centre of human nucleoside transporter hCNT1 implicated in the transport of antiviral/anticancer drugs through novel experimental approaches
Antivirális és rákellenes hatóanyagok sejtbejutásáért felelős humán hCNT1 nukleozid transzporter szubsztrátkötő centrumának meghatározása új kísérleti rendszer kifejlesztésével (EGT/Norvég Alap HU0069/NA/2006-2/PA-8)
Title in English
Determination of substrate binding centre of human nucleoside transporter hCNT1 implicated in the transport of antiviral/anticancer drugs through novel experimental approaches
Keywords in Hungarian
humán koncentratív nukleozid transzporter, szubsztrát kötő centrum, random mutáns génkönyvtár
Keywords in English
human concentrative nucleoside transporter, substrate binding centre, random mutant gene bank
Discipline
Microbiology: virology, bacteriology, parasitology, mycology (Council of Medical and Biological Sciences)
100 %
Ortelius classification: Microbiology
Panel
Immunity, Cancer and Microbiology
Department or equivalent
Department of Microbiology (University of Szeged)
Starting date
2009-04-01
Closing date
2011-03-31
Funding (in million HUF)
25.416
FTE (full time equivalent)
1.40
state
closed project
Summary in Hungarian
Az antimetabolikus hatóanyagokat széleskörben alkalmazzák a rák- és vírusellenes kemoterápiákban. A legtöbb nukleozid alapú hatóanyag Na(+)-szimporter koncentratív nukleozid transzporterek (CNTk) által jut a sejtekbe. A CNTk meghatározzák és modulálják a nukleozid-analóg hatóanyagok sejtbejutását, esetenként szövetspecifikusan. Annak ellenére, hogy a szubsztrátok és a transzporterek elsődleges- és másodlagos szerkezete közötti kapcsolat ismerete elősegítené a gyógyszerfejlesztésekre irányuló kutatásokat, a szubsztrátkötő centrumok teljes feltérképezése nem történt meg, és jelenleg csak részleges ismereteink vannak bizonyos szubsztrátok bizonyos aminosavakkal való kölcsönhatásáról. Az enzim szerkezet-hatás kapcsolatának megismerése a szubsztrátkötő centrum teljes feltérképezése által hatékonyabbá tenné az új, farmakológiai szempontból aktív, nagy affinitású rákellenes gyógyszerek kifejlesztését. A pályázat célja, hogy újszerű vizsgálati megközelítési módszerrel meghatározzuk a humán CNT1 szubsztrátkötő centrumát.
Summary
Transport of nucleoside analogs, the antiviral/anticancer drugs across biological membranes is mediated by specific transport proteins. Many of tissue-specific variants of equilibrative and concentrative nucleoside transporters have been identified. They seem to vary in their substrate specificity and kinetic characteristics and by so, the design and development of tissue-specific anticancer drugs is possible. The ability of the concentrative nucleoside transporters to transport nucleoside drugs is an absolute requirement for the therapeutic effectiveness or toxicity of these drugs. In order to increase the effectiveness and specificity of drugs used in chemotherapy, and reduce harmful side effects, a better understanding of the basic molecular mechanism(s) of nucleoside transport is essential, it could enable the design of more effective nucleoside drugs and those with improved and specific absorption profile. Since the topology of the substrate-binding centre determines the chemical structure requirements for the putative substrates, the information on the structure of the substrate-binding centre can facilitate the development of new drugs, and the binding-affinity of the target transporters for the novel drugs could be predicted more precisely. Currently, the rational design of nucleoside drugs is hindered by the absence of high resolution structural data on the relevant transporters. In this project the applicant intends to build up a powerful experimental system based on mutational analysis using a complex molecular biological strategy in order to reveal the structure-activity relationship of human concentrative nucleoside transporters and synthesise the results into three-dimensional models of substrate binding centres. In the future similar experimental systems could be designed for the investigation of other therapeutically important transporters.
Final report
Results in Hungarian
1. Mutáns génbankokat hoztunk létre a humán hCNT1 cDNS-ből, valamint a 2. pontban létrehozott funkcióvesztéses mutáns E497Q-hCNT1 cDNS-ből (technikai kontrol), és funkciónyeréses mutánsok izolálásához elkezdtük a transzformációs kísérleteket.
2. Létrehoztuk az E497Q-hCNT1 funkcióvesztéses mutánst a hCNT1 cDNS molekula irányított pontmutációjával a mutáns génbank létrehozásának technikai ellenőrzése céljából.
3. Létrehoztuk az Aspergillus nidulans cntA::riboB pyrG89 pantoB100 riboB2 deléciós recipiens törzset a cntA::riboB pyrG89 pyroA4 biA1 riboB2 és pantoB100 riboB2 törzsek keresztezésével. A recipiens törzs a humán hCNT1 heterológ expressziós rendszerben történő funkcionális kifejeződésének ellenőrzését szolgálja, valamint az E497Q-hCNT1 funkcióvesztéses mutáns molekulából létrehozott mutáns génbank transzformációját szolgálja.
4. Létrehoztunk egy új, autonóm replikatív Aspergillus expressziós vektort. A 13,2 kb méretű pNNPanto vektort a pAnGFP integrálódó GFP fúziós kiindulási expressziós vektorból hoztuk létre 4 módosítást követően.
5. A hCNT1 és a 2. pontban leírt E497Q-hCNT1 funkcióvesztéses mutáns hCNT1 cDNS heterológ expressziós rendszerben történő kifejeztetésével igazoltuk, hogy a hCNT1 aktív uridin transzportert fejez ki A. nidulansban, valamint ellenőriztük, hogy a mutáns E497Q-hCNT1 nem képes uridin szállításra.
6. Létrehoztunk különböző „uptake” deficiens recipiens törzseket a mutáns génbankok transzformálására és a funkciónyeréses mutánsok screeneléséhez.
Results in English
1. Mutant gene banks from human hCNT1 cDNA and hCNT1 cDNA derived non-functional E497Q-hCNT1 molecule (for technical control purpose) were constructed and used for screening of gain-of-function mutants.
2. A non-functional E497Q-hCNT1 mutant hCNT1 cDNA molecule was constructed by directed point mutagenesis for the purpose of generation and using the E497Q-hCNT1 mutant gene bank to evaluate technically the process of mutant gene bank generation.
3. cntA::riboB pyrG89 pantoB100 riboB2 A. nidulans deletion mutant was developed by crossing cntA::riboB pyrG89 pyroA4 biA1 riboB2 with pantoB100 riboB2 for the purpose of test-transformation of (i) hCNT1 and E497Q-hCNT1 in the heterologue expression system; (ii) transformation with E497Q-hCNT1 mutant gene bank.
4. Novel autonomous expression vector of A. nidulans, pNNPanto was developed by engineering the existing pAnGFP integrative GFP fusion A. nidulans vector in four steps.
5. Heterologous expression of the human hCNT1 and E497Q-hCNT1 and the expression of A. nidulans CntA (AN5493.3) cDNAs cloned in pNNPanto autonomous expression vector were carried out in cntA::riboB pyrG89 pantoB100 riboB2 recipient strain.
6. Hypoxanthine/uric acid uptake deficient mutant uapA24 uapC201/401 azgA4 pantoB100 was developed by cross of uapA24 uapC201/401 azgA4 pabaA1 strain with pantoB100 riboB2 mutant for the purpose of direct screening for gain-of-function mutants.
Hamari Z., Amillis S., Drevet C., Apostolaki A., Vágvölgyi C., Diallinas G., Scazzocchio C: Convergent evolution and orphan genes in the Fur4p-like family and characterization of a general nucleoside transporter in Aspergillus nidulans., Mol. Microbiol. 73(1): 43-57, 2009
Hamari, Z., Vágvölgyi, C., Scazzocchio, C.: Identification of FUR-4-like nucleobase transporter family in Aspergillus nidulans., 11th regional conference on environment and health.Abstract. 15/16 May 2009, Szeged, Hungary, 2009
Z. Karácsony, Z. Hamari: Construction of a bidirectional E. coli/Aspergillus nidulans autonomous replicative expression vector., Annual Conference of MMT (Hungarian Society of Microbiologists) Keszthely, Hungary, 13-15/October/ 2010. Mycology section, poster: MP-1., 2010
