Elucidating the contribution of citric acid cycle enzymes and cyclophilin D in mitochondrial phosphorylation potential using multiple transgenic mice strains
A citrátciklus enzimek és a ciklofilin D mitokondriális foszforilációban betöltött szerepének megvilágítása transzgénikus egértörzsek felhasználásával
Title in English
Elucidating the contribution of citric acid cycle enzymes and cyclophilin D in mitochondrial phosphorylation potential using multiple transgenic mice strains
Metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
45 %
Metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
45 %
Ortelius classification: Metabolism
Molecular and cellular neuroscience (Council of Medical and Biological Sciences)
10 %
Panel
Physiology, Pathophysiology, Pharmacology and Endocrinology
Department or equivalent
Dept. of Medical Biochemistry (Semmelweis University)
Participants
Kiss, Gergely Konrád, Csaba Törőcsik, Beáta
Starting date
2011-04-01
Closing date
2012-03-31
Funding (in million HUF)
6.398
FTE (full time equivalent)
2.43
state
closed project
Summary in Hungarian
A citrátkör enzimeinek defektusai – különös tekintettel az α-ketoglutarát-dehidrogenáz komplexre (KGDHK) – elsősorban az Alzheimer-kórral (AD), de számos további krónikus megbetegedéssel is összefüggésbe hozhatóak. AD-ban szenvedett betegek post-mortem szöveteiben kimutatható csökkent KGDHK, és ezzel egyidejűleg emelkedett malát-dehidrogenáz aktivitás világosan alátámasztja ezeknek az enzimeknek a jelentőségét a betegség kóroktanában. A tervezett kísérletek elvégzését olyan transzgenikus egértörzsek létrehozása tette lehetővé, melyekben a következő genetikai módosítások mutatkoznak: i) KGDHK E2 (dihidrolipoil- transzszukciniláz, DLST) vagy E3 (dihidrolipoil-dehidrogenáz, DLD) alegység defektusban szenvedő egér, mitokondriális malát-dehidrogenáz (MDH2) deficiens egér, szukcinil-CoA-ligáz ATP-termelő alegység (SUCLA2) deficiens egér, ciklofilin D (cypD) -hiányos egér. Tervezzük: i) DLST+/- és DLD+/-, valamint SUCLA2+/- egerek keresztezését a cypD-/- egerekkel. Így 3 dupla knock-out törzset (DLST+/-cypD-/-, DLD+/-cypD-/- és SUCLA2+/-cypD-/-) létrehozva arra keresnénk választ, hogy a cypD genetikai deléciójával járó magasabb mátrix ATP/ADP arány kompenzálja-e a KGDHK E2 vagy E3 alegységét, ill. a SUCLA2-t kódoló egyik allél deléciójából eredő csökkent mátrix ATP/ADP arányt. ii) Kereszteznénk a DLST+/- és a MDH2+/- egereket, hogy az így létrehozott dupla knock-out (DLST+/-MDH2+/-) egéren azt vizsgáljuk, vajon az emelkedett MDH2 aktivitás megszűntetése egy DLST allél deléciójával együtt hasznos vagy éppen káros hatású. Ezen in vivo genetikai manipulációk által felfedhető lenne a KGDHK, a MDH2 és az ATP-termelő szukcinil-CoA-ligáz szerepe a mitokondriális foszforilációs potenciál kialakításában, és ezek az ismeretek hozzásegíthetnének minket azon betegségek patogenezisének jobb megértéséhez, melyekben a fenti enzimek érintettek. A cypD-hez kapcsolódó genetikai módosítások előnyös hatásai révén a későbbiekben ezen a területen is elsődleges farmakológiai célponttá válhat, ahogy ez már bekövetkezett más, nem szorosan ide kapcsolódó betegségekben esetén.
Summary
Alterations in the activities of citric acid cycle enzymes, most notably of the alpha ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC), have been implicated in several chronic diseases, particularly in Alzheimer’s disease. A decrease in KGDHC activity in post-mortem tissues of patients with Alzheimer’s disease along with a concomitant increase in malate dehydrogenase activity underscore the significance of these enzymes to disease pathology. The proposed experiments will benefit from the availability of transgenic mice with deficiencies in the E2 (dihydrolipoyl succinyltransferase, DLST) or E3 (dihydrolipoyl dehydrogenase, DLD) subunit of KGDHC, mitochondrial malate dehydrogenase (MDH2), ATP-forming subunit of succinyl CoA ligase (SUCLA2), and cyclophilin D (cypD). We propose to: i) cross DLST+/-, DLD+/- and SUCLA2+/- mice with cypD-/- mice, thus generating three double knock-outs, DLST+/-cypD-/-, DLD+/-cypD-/- and SUCLA2+/-cypD-/-, and examine whether the greater matrix ATP/ADP ratios conferred by genetic deletion of cypD compensates for the decreased ATP/ADP ratios conferred by deletion of one of the alleles coding for the E2 or E3 subunit of KGDHC or the ATP-generating subunit of succinyl-CoA ligase; and ii) cross the DLST+/- mice with the MDH2+/- mice, thus generating the double knock-out DLST+/-MDH2+/- and examine whether the abolition of the increased MDH2 activity accompanying the deletion of one DLST gene allele is a rebound beneficial or an additive deleterious effect. These in vivo genetic manipulations will expose the contributions of KGDHC, MDH2 and ATP-forming succinyl CoA ligase in the mitochondrial phosphorylation potential, and as such contribute to a better understanding of the pathogenesis of diseases associated with alterations involving these enzymes. A beneficial effect obtained from involving cypD genetic manipulations will mark this protein as a primary target amenable to pharmacologic exploitation, an undertaking which currently enjoys success in combating unrelated human diseases.
Final report
Results in Hungarian
Az NNF2 85658-as pályázattal kapcsolatos előrelépések:
i) A vad típusú, DLD +/- és DLST +/- egerekből nyert agy és máj eredetű izolált mitokondriumokon, izolált idegvégződéseken, kitenyésztett idegsejteken és asztrocitákon minden kísérletet elvégeztünk; ii) a DLD +/- DLST +/- dupla KO egerekből nyert agy és máj eredetű izolált mitokondriumokon és izolált idegvégződéseken a kísérletek nagy részét elvégeztük; iii) a DLD+/- cypD-/- dupla KO egerekből nyert agy és máj eredetű izolált mitokondriumokon minden kísérletet elvégeztünk. A DLST+/- cypD-/- dupla KO egerekkel még nem végeztünk kísérletet; iv) A SUCLA2 gén-kiütött egereket végül sikerrel létrehozták, Június 1-én érkezik 4 hím +/- és 4 nőstény +/- egér. SUCLA2 -/- egér ezidáig nem született (lehet, hogy perigasztrális elhalálozással jár); v) az MDH2 transzgenikus egerek (b variáns) nem mutattak csökkent MDH aktivitást, így nem kereszteztük őket egyik fenti törzzsel sem; vi) kísérleteink során arra a következtetésre jutottunk, hogy a légzési lánc cytochrome b5 reduktáza (cyb5r) az általunk tapasztalt jelenség fontos mediátora, és a PI elnyert egy kisebb pályázatot mely fedezi a cyb5r 2-es izoformára kiütött egérkolónia beszerzését az EUCOMM-tól. Jelenleg ezek az egerek szaporítás alatt vannak az EOK SPF állatházában. Kísérleteink rámutatnak a mitokondriális diaforázok fontosságára a mátrix NADH/NAD+ arány fenntartásában, mely témát a jövőben aktívan vizsgálni fogjuk.
Results in English
The progress on grant NNF2 85658 is as follows:
i) all experiments on isolated brain and liver mitochondria, isolated nerve terminals, and cultured neurons and astrocytes from WT, DLD+/-, DLST+/- mice have been completed; ii) most experiments on DLD+/- DLST+/- double KO mice have been completed on isolated brain and liver mitochondria, and isolated nerve terminals; iii) all experiments on DLD+/- cypD-/- double KO mice have been completed in isolated brain and liver mitochondria. No experiments have been performed yet on DLST+/- cypD-/- double KO mice; iv) the SUCLA2 mice have finally been generated, as of June 1st we have 4 male +/- and 4 female +/- mice. No -/- SUCLA2 mice have been born yet (perhaps this is associated with perigastrulation lethality); v) the MDH2 transgenic mice (b variant) did not exhibit a decreased activity in MDH, therefore they were not crossed with any of the other transgenic mice; vi) in the course of our experiments we deduced that an important component mediating the phenomena that we observed is the cytochrome b5 reductase (cyb5r) of the respiratory chain, and the PI won a small grant (waving the costs for obtaining a transgenic mouse colony) for obtaining cyb5r isoform 2 knock-out mice from EUCOMM. The mice are currently breeding in our SPF facility of the EOK. Our experiments point out the importance of mitochondrial diaphorases participating in the maintenance of matrix NADH/NAD pools, and this will be actively pursued in the future.
