A Lae1-típusú epigenetikus szabályozás növekedési ráta-függése Trichoderma reesei gombában  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »
 

Projekt adatai

  
azonosító
100660
típus K
Vezető kutató Fekete Erzsébet
magyar cím A Lae1-típusú epigenetikus szabályozás növekedési ráta-függése Trichoderma reesei gombában
Angol cím Growth rate dependence of Lae1-type epigenetic regulation in the fungus Trichoderma reesei
magyar kulcsszavak kemosztát, Lae1, Trichoderma reesei, microarray
angol kulcsszavak cellulase, Lae1, Trichoderma reesei, microarray
megadott besorolás
Mikrobiológia: virológia, bakteriológia, parazitológia, mikológia (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)50 %
Epigenetika és génszabályozás (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)40 %
Általános biokémia és anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)10 %
Ortelius tudományág: Molekuláris biológia
zsűri Immun-, Tumor- és Mikrobiológia
Kutatóhely TTK Biomérnöki Tanszék (Debreceni Egyetem)
résztvevők Csákiné Jäger Szilvia
Karaffa Levente
Molnár Ákos Péter
Németh Zoltán
projekt kezdete 2012-04-01
projekt vége 2015-03-31
aktuális összeg (MFt) 15.411
FTE (kutatóév egyenérték) 3.00
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
Az Aspergillus gombagenus több fajában a szekunder metabolizmushoz szükséges enzimeket kódoló gén-klaszterek epigenetikus szabályozás alatt állnak, melyért a LaeA nevű metiltranszferáz enzim a felelős. A LaeA ezáltal a szekunder anyagcsere egyik meghatározó szabályozója Aspergillusok-ban. Mivel a szekunder metabolitok közé számos kereskedelmileg jelentős termék tartozik, a LaeA homológjai – melyekről ma már tudjuk, hogy a többsejtű Ascomycota fajokban általánosan jelen vannak – komoly célpontjai lehetnek a gomba eredetű metabolitok ipari termelését megcélzó fejlesztéseknek.
A Trichoderma/Hypocrea gombagenus számos olyan fajt foglal magába, melyek antibiotikumok, ipari enzimek, biofungicidek kereskedelmi léptékű termelése okán váltak ismerté. A T. reesei genom adatbázisában valóban megtalálták a feltételezett LaeA ortológot (Trire2: 41617 – LAE1). Annak kiderítésére, hogy ez a felső szintű szabályzó pontosan milyen szerepet játszik a szekunder anyagcserében, a T. reesei lae1 nullmutánst (lae1) és a T. reesei lae1 túltermelő mutánst (tef1:lae1) fogjuk használni.
A szekunder metabolitok képződése erősen függ a termelő organizmus fizikai és kémiai környezetétől, legfőképpen pedig a tenyészet specifikus növekedési rátájától. A tenyésztési körülmények szabályozhatóságának igénye miatt kemosztát típusú folytonos fermentációs rendszert fogunk alkalmazni. Korábban bebizonyítottuk, hogy definiált hígitási (= specifikus növekedési) rátán, kizárólagos limitáló szénforrásként D-glükózt használva lehetséges a T. reesei tenyészet gyors növekedési szakaszát (D = 0.080 h-1), lassú növekedési szakaszát (D = 0.040 h-1) és a stacioner fázist (D = 0.020 h-1) szimulálni.
Kísérleti rendszerünk képes lesz arra, hogy azonosítson olyan (akár funkcionálisan ismeretlen) géneket, melyek közvetlenül vagy közvetve a LAE1 hatása alatt állnak. Emiatt genomszintű megközelítést alkalmazunk; a T. reesei összes (9130 db) egyedi alléljét tartalmazó DNS-mikrochip segítségével fogjuk vizsgálni a glükózon, definiált specifikus növekedési rátán keletkező transzkriptumot. A DNS-chip adatainak megbízhatóságát véletlenszerűen kiválasztott, de különböző csoportokba tartozó gének kifejeződésének Real-Time PCR-rel történő vizsgálata során fogjuk leellenőrizni. A kutatás stratégiai célja tehát a T. reesei genom felosztása LAE1-függő, LAE1-független illetve specifikus növekedési ráta-függő és attól független csoportokra. A T. reesei gomba élettanának alaposabb megismerésén túl a létrejövő adatbázis segítségül szolgálhat a törzsfejlesztő programok számára is.
angol összefoglaló
In the fungal genus Aspergilli, clusters of secondary metabolite genes are epigenetically regulated at an upper hierarchic level by the protein methyltransferase LaeA. Thus, LaeA is a crucial regulator of secondary metabolism in Aspergilli. Since secondary metabolites constitute a large number of commercial products, the LaeA homologues – which are known to be universally present in multicellular ascomycetes – could serve as major targets to improve industrial production of fungal metabolites.
The Trichoderma/Hypocrea genus contains several strains as sources of enzymes, antibiotics, metabolizers of xenobiotics and commercial biofungicides. In the genome database of T. reesei, protein Trire2: 41617 could indeed be identified as the putative LaeA orthologue, LAE1. To characterize the role this epigenetic regulatory protein may play in secondary metabolism, T. reesei Lae1 deletion mutants (lae1) and T. reesei lae1 overproducing mutants (tef1:lae1) will be employed. However, secondary metabolite formation is known to be strongly dependent on the physical and chemical environment of the organism, but most notably on the specific growth rate of the cells.
In order to properly address these concerns, we are going to employ a chemostat-type continuous cultivation system. Previously, we have provided evidence that by employing defined dilution (= specific growth) rates on glucose as a sole limiting substrate in the medium, it is possible to mimick the rapid growth stage (D = 0.080 h-1), the slow growth stage (D = 0.040 h-1) as well as the stationary stage (D = 0.020 h-1) of a batch cultivation of T. reesei. A chemostat culture in steady-state will allow us to discriminate between the regulatory effects by LAE1 and the influence of growth rate (equivalent to the nutritional condition) of the fungus and the other environmental parameters that may otherwise influence expression. This experimental system has the potential to unambiguously identify new genes directly or indirectly under the influence of LAE1. To this end, we are going to use a genome-wide approach where microarrays representing all 9130 unique alleles in the genome of T. reesei will be used to examine their transcript levels when grown on glucose as a limiting carbon source at defined growth rates. To confirm microarray results, quantitative Real-Time-PCR will be performed on selected T. reesei genes belonging to different clusters. This way, we may acchive the strategic aim of this research, e.g. clustering T. reesei genome into LAE1-dependent, LAE1-independent, specific growth rate-dependent and growth rate independent parts. Our result may represent an area so far overlooked for strain improvement by recombinant techniques. In addition, data on the regulation of gene transcription via changes in the chromatin structure may provide a deeper molecular understanding of the trophophase-idiophase concept of fungal secondary metabolite synthesis.




 

Zárójelentés

  
kutatási eredmények (magyarul)
In Trichoderma reesei, the global regulator methyltransferase LAE1 regulate expression of cellulases and polysaccharide hydrolases genes. Since the respective loss-of-function and overexpressing mutants display different growth rates, thus some of the properties attributed to LAE1 could be due to changes in the growth rate. We thus cultivated T. reesei, a Δlae1 mutant and a lae1-overexpressing strain in chemostats on glucose at two different growth rates (0.075 and 0.020 h-1) to mimick growth rates at repressing and derepressing conditions, respectively. The effect of modulated LAE1 expression was mainly visible in the Δlae1 mutant. GCN5-N-acetyltransferases, amino acid permeases and flavin monooxygenases were identified as so far unknown targets of LAE1 action. LAE1 was also shown to interfere with the regulation of expression of several genes by the growth rate. In Aspergillus nidulans, orthologue of LAE1 - LaeA - is part of the VELVET protein complex consisting of LaeA, VeA and VelB that regulates secondary metabolism. We have therefore investigated the function of VEL1, the T. reesei orthologue of A. nidulans VeA. Deletion of T. reesei vel1 caused a complete loss of conidiation, altered hyphal morphology towards hyperbranching, and reduced growth rates. Importantly, deletion of vel1 completely impaired the expression of cellulases, and xylanases. Our data show that in T. reesei cellulase gene expression by LAE1 occurs by the VELVET complex.
kutatási eredmények (angolul)
A Trichoderma reesei gombában a celluláz és poliszacharid hidroláz gének kifejeződését egy metiltranszferáz funkciójú globális regulátor, a LAE1 szabályozza. Mivel a hiány- illetve túltermelő mutáns törzsek eltérő növekedési rátával rendelkeznek, a LAE1-nek tulajdonított tulajdonságok a növekedési ráta megváltozásával is magyarázhatók. Emiatt a vad típusú, a Δlae1 mutáns és a lae1-túltermelő törzseket konstans növekedési rátát biztosító kemosztátban, két különböző hígítási rátán (0,075 és 0,020 h-1) tenyésztettük, a represszáló/derepresszáló körülményeket szimulálva. A lae1 megváltozott hatása főleg a hiánymutánsban jelentkezett. A LAE1 eddig ismeretlen célpontjai között GCN5-N-acetiltranszferázok, aminosav permeázok és flavin mono-oxigenázok voltak. A LAE1 számos gén kifejeződését a növekedési rátán keresztül befolyásolta. Aspergillus nidulans-ban a LAE1ortológja – a LaeA – a szekunder anyagcserét szabályozó VELVET fehérje komplex része, mely a LaeA, VeA és VelB proteinekből épül fel. Emiatt részletesen tanulmányoztuk az A. nidulans VeA T. reesei-ben található ortológjának, a VEL1-nek a funkcióját. A T. reesei vel1 gén kiütése a konídium képződés képességének teljes elvesztésével, a hifák fokozott elágazódásával valamint lecsökkent növekedési rátával járt együtt. A vel1 kiütése megakadályozta továbbá a celluláz és xilanáz gének kifejeződését is. Eredményeink azt mutatják, hogy T. reesei-ben a celluláz gének LAE1 általi szabályozása a VELVET komplexen keresztül történik.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=100660
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

  
KARAFFA L, COULIER L, FEKETE E, OVERKAMP KM, DRUZHININA IS, MIKUS M, SEIBOTH B, NOVÁK L, PUNT PJ, KUBICEK CP: The intracellular galactoglycome in Trichoderma reesei during growth on lactose., APPL MICROBIOL BIOT 97: 5447-5456, 2013
Fekete E, Karaffa L, Seiboth B, Fekete É, Kubicek CP, Flipphi M: Identification of a permease gene involved in lactose utilisation in Aspergillus nidulans., Fungal Genetics and Biology, 49: 415–425., 2012
Karaffa L, Coulier L, Fekete E, Overkamp KM, Druzhinina IS, Mikus M, Seiboth B, Novák L, Punt PJ, Kubicek CP: The intracellular galactoglycome in Trichoderma reesei during growth on lactose., Applied Microbiology and Biotechnology, DOI: 10.1007/s00253-012-4667-y., 2013
Asadollahi M, Fekete E, Karaffa L, Flipphi M, Árnyasi M, Esmaeili M, Váczy K, Sándor E: Comparison of Botrytis cinerea populations isolated from two open-field cultivated host plants., Microbiological Research, 168: 379-388., 2013
Jónás Á, Fekete E, Flipphi M, Sándor E, Jäger Sz, Molnár ÁP, Szentirmai A, Karaffa L: Extra- and intracellular lactose catabolism in Penicillium chrysogenum: phylogenetic and expression analysis of the putative permease and hydrolase genes., The Journal of Antibiotics, doi:10.1038/ja.2014.26., 2014
FLIPPHI M, FEKETE E, ÁG N, SCAZZOCCHIO C, KARAFFA L: Spliceosome twin introns in fungal nuclear transcripts., FUNGAL GENET BIOL 57: 48-57, 2013
KARAFFA L, COULIER L, FEKETE E, OVERKAMP KM, DRUZHININA IS, MIKUS M, SEIBOTH B, NOVÁK L, PUNT PJ, KUBICEK CP: The intracellular galactoglycome in Trichoderma reesei during growth on lactose., APPL MICROBIOL BIOT 97: 5447-5456, 2013
FEKETE E, DE VRIES R P, SEIBOTH B, VANKUYK P, SÁNDOR E, FEKETE É, METZ B, KUBICEK C P, KARAFFA L: D-galactose uptake is non-functional in the conidiospores of Aspergillus niger., FEMS MICROBIOL LETT 329: 198-203, 2012
Fekete E, De Vries RP, Seiboth B, vanKuyk P, Sándor E, Fekete É, Metz B, Kubicek CP, Karaffa L: D-galactose uptake is non-functional in the conidiospores of Aspergillus niger., FEMS Microbiology Letters, 329: 198-203., 2012
FEKETE E, KARAFFA L, KARIMI AGHCHEH R, NÉMETH Z, FEKETE É, OROSZ A, PAHOLCSEK M, STÁGEL A, KUBICEK C P: The transcriptome of lae1 mutants of Trichoderma reesei cultivated at constant growth rates reveals new targets of LAE1 function, BMC GENOMICS 15: 447-456, 2014
FEKETE E, KARAFFA L, KARIMI AGHCHEH R, NÉMETH Z, FEKETE É, OROSZ A, PAHOLCSEK M, STÁGEL A, KUBICEK C P: The transcriptome of lae1 mutants of Trichoderma reesei cultivated at constant growth rates reveals new targets of LAE1 function, BMC GENOMICS 15: 447-456, 2014
KARIMI AGHCHEH R., NÉMETH Z., ATANASOVA L., FEKETE E., PAHOLCSEK M., SÁNDOR E., AQUINO B., DRUZHININA I.S., KARAFFA L., KUBICEK C.P.: The VELVET A orthologue VEL1 of Trichoderma reesei regulates fungal development and is essential for cellulase gene expression, PLoS One, 9: e112799., 2014
OROSZ A., FEKETE E., FLIPPHI M., KARAFFA L.: Metabolism of D-galactose is dispensable for the induction of the beta-galactosidase- (bgaD) and lactose permease (lacpA) genes in Aspergillus nidulans, FEMS Microbiology Letters, 359: 19–25., 2014




 

Projekt eseményei

  
2014-04-28 17:31:08
Résztvevők változása
2011-07-11 08:28:05
Kutatóhely váltás
A kutatás helye megváltozott. Korábbi kutatóhely: TTK Genetikai és Alkalmazott Mikrobiológiai Tanszék (Debreceni Egyetem), Új kutatóhely: TTK Biomérnöki Tanszék (Debreceni Egyetem).



vissza »