A ZAP-70 kináz szerepének vizsgálata egy rheumatoid arthritis modell patogenezisében  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
101493
típus K
Vezető kutató Boldizsár Ferenc
magyar cím A ZAP-70 kináz szerepének vizsgálata egy rheumatoid arthritis modell patogenezisében
Angol cím Investigating the role of ZAP-70 kinase in the pathogenesis of an autoimmune model of rheumatoid arthritis
magyar kulcsszavak rheumatoid arthritis, T sejt jelátvitel, ZAP-70, transzgenikus egér
angol kulcsszavak rheumatoid arthritis, T cell signaling, ZAP-70, transgenic mice
megadott besorolás
Immunológiai betegségek biológiai alapjai (pl. autoimmunitás) (Orvosi és Biológiai Tudományok)80 %
Jelátvitel (Orvosi és Biológiai Tudományok)20 %
zsűri Immun-, Tumor- és Mikrobiológia
Kutatóhely Immunológiai és Biotechnológiai Intézet (Pécsi Tudományegyetem)
résztvevők Bender Balázs
Berki Timea
Kvell Krisztián
Szabó Mariann
Tarjányi Oktávia
projekt kezdete 2012-02-01
projekt vége 2017-01-31
aktuális összeg (MFt) 24.000
FTE (kutatóév egyenérték) 6.87
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
Összefoglalás
A rheumatoid arthritis (RA) szisztémás autoimmun betegség, ami az izületek krónikus gyulladásához vezet. A rekombináns humán proteoglikán G1-domén (rhG1) által indukált arthritis (GIA) modell egérben sok hasonlóságot mutat RA-el. A T sejtek patogenetikai szerepe mind RA-ban mind GIA-ban jól ismert. Az autoimmunitás kialakulásában különösen fontos szerepet játszik a T sejt receptoron (TcR) keresztül folyó jelátvitel, mert ez szabályozza az aktiváció-indukált sejthalált, ami a potenciálisan káros, aktivált autoreaktív T sejtek eltávolításáért felelős.
A jelen pályázatban a TcR jelátvitel egyik központi molekulája, a ZAP-70 kináz szerepét fogjuk vizsgálni a GIA patogenezisében. Transzgenikus (Tg) egereket készítünk: ZAP-70-/- egerekben lentivirális géntranszfer segítségével helyreállítjuk a ZAP-70 expresszióját WT-, vagy tirozin-fenilalanin (Y-F) egyszeres pontmutációkat tartalmazó ZAP-70 molekula konstrukciókkal. A ZAP-70-/-, WT- vagy Y126F-, Y492F- és Y493F-ZAP-70-Tg egerekben a GIA érzékenység és súlyosság változásait fogjuk vizsgálni és összevetni az immunológiai fenotípussal, TcR jelátvitellel és apoptosis hajlammal. A Y126 újonnan leírt regulációs, a Y492 gátló, míg a Y493 domináns aktiváló aminosav maradékok a ZAP-70 molekulában, ezért funkcióvesztő (Y-F) mutációjuk változatos hatással lehet a TcR jelátvitelre, apoptosisra és a betegség (GIA) kialakulására.

A kutatás alapkérdése
A TcR jelátvitel változásai és a károsodott apoptosis mechanizmusok szerepet játszhatnak a RA patogenezisében. A ZAP-70 patogenetikai szerepe szintén felmerült, ezért jelen pályázatunkban arra keresünk választ, hogy milyen szerepet tölt be a ZAP-70 kináz a RA egyik egér modelljének, a GIA-nak kialakulásában. Feltételezzük, hogy a ZAP-70-/- egerek funkcionális T sejtek hiányában ellenállóak lesznek a GIA-val szemben, de a ZAP-70 molekula expressziójának visszaállításával ismét érzékennyé válnak a betegségre. A Y-F pontmutáns ZAP-70 molekulát expresszáló Tg egerek előállításával tanulmányozni fogjuk ennek a kináznak a finom szabályozó szerepét GIA-ban, különös tekintettel a betegség iránti fogékonyságra és az arthritis súlyosságára. A ZAP-70-/-, WT- vagy Y126F- Y492F- és Y493F-ZAP-70-Tg egerek immunfenotípusát, TcR jelátvitelét és apoptózisát, és a rhG1 ellenes immunválaszt részletesen fogjuk vizsgálni és összefüggéseket keresünk a klinikai fenotípusokkal.

A kutatás jelentősége
Munkánk segíthet tisztázni a ZAP-70 kináz és a T sejt jelátvitel pontosabb szerepét az autoimmun arthritis kialakulásában. Az újonnan előállított Y126F-, Y492F- és Y493F mutáns ZAP-70 Tg egerek segítségével mi lehetünk az elsők, akik egy T sejt jelátviteli fehérje célzott genetikai változásainak az arthritis klinikai képére kifejtett hatását vizsgálnánk. Így lehetővé válik egy finom molekuláris mechanizmus tesztelése megbízható in vivo rendszerben, ami hozzájárulhat a T sejt jelátvitel szerepének jobb megértéséhez az arthritis kialakulásában. Pályázatunk tehát immunológiai alapkutatás betegség modellben való alkalmazására épül.
A fenti ZAP-70 Tg egerek létrehozása lehetővé teszi a későbbiekben számos immunológiai kérdés vizsgálatát, például a TcR jelátvitel, apoptosis és differenciáció területein, különféle hatásokra és eltérő autoimmun modellekben. Előzetes vizsgálatok más Y-F mutáns ZAP-70 Tg egerekben már bebizonyították, hogy ezek a mutációk fontos immunológai következményekkel járnak in vivo.
Végül, a GIA, ami egy új egér autoimmun arthritis modell, bevezetésre kerül laboratóriumunkben (Immunológiai és Biotechnológiai Intézet). A Prof. Dr. Glant. T.-al (Rush University Medical Center, Chicago, IL, USA) zajló szoros együttműködés részeként mi alkalmazhatjuk a világon másodikként, és Magyarországon elsőként ezt az autoimmun modellt. A jelen kutatási tervben részletezett célok mellett ez a modell alkalmas lehet a jövőben sok más kutatási projekt megvalósítására is.

Összefoglalás (laikusok számára)
A reumatoid artritisz (RA) egy izületi gyulladással járó autoimmun betegség, ami világszerte a lakosság kb. 1%-át érinti. Bár a pontos kiváltó ok(ok) még nem ismertek, az bizonyított, hogy az immunrendszer kóros működése állhat a betegség hátterében. Ebben a folyamatban a T limfociták központi szabályozó szerepet töltenek be. Ezek a sejtek receptoraikkal valószínűleg felismerik az izületi szövetekben található molekulákat, amely a sejtekben belső jeltovábbítási folyamatokat indít be és végül az aktivációjukhoz vezet. Részben ezen mechanizmusok finom változásai vezethetnek oda, hogy végül az izület ellen autoimmun reakció indul el.
Jelen pályázatunkban genetikailag manipulált transzgenikus egereket hozunk létre és bennük váltunk ki a RA-hoz hasonló autoimmun izületi gyulladást. Ezek az egerek a T limfociták egyik fontos jeltovábbító molekulájának, a ZAP-70-nek, különböző változatait fogják hordozni, így lehetőségünk lesz megismerni ennek a molekulának a pontosabb szerepét az artritisz kialakulásában. Összehasonlítjuk, hogy a ZAP-70 különféle variánsait hordozó egerek mennyire „fogékonyak” az artritiszre, illetve a mennyire súlyos betegség fejlődik ki bennük. Munkánk során vizsgálni fogjuk a jeltovábbításban, a programozott sejthalálban és az immunrendszerben bekövetkező változásokat. Ezen adatok összevetéséből fontos következtetéseket vonhatunk le a ZAP-70 illetve a T limfocita jeltovábbítás szerepére az autoimmun izületi gyulladás kialakulásában.
angol összefoglaló
Summary
Rheumatoid arthritis (RA) is a systemic autoimmune disease leading to chronic inflammation of the joints. A mouse model, recombinant human proteoglycan-G1-domain (rhG1)-induced arthritis (GIA), developed recently, shares many similarities with RA. The pathogenic role of T cells is well established in both RA and GIA. In the development of autoimmunity, altered T cell receptor (TcR) signaling is of special importance, because, through the regulation of activation-induced cell death (AICD), it is responsible for the elimination of potentially harmful, activated self-reactive T cells.
In the present proposal, the role of ZAP-70 kinase, a key TcR signaling molecule, will be investigated in the pathogenesis of GIA. Transgenic (Tg) mice will be generated: ZAP-70-/- mice will be reconstituted with WT-, or tyrosine-phenylalanine (Y-F) single point mutant ZAP-70 constructs using lentiviral gene delivery. GIA susceptibility and severity will be evaluated in ZAP-70-/-, WT- or Y126F-, Y492F and Y493F-ZAP-70-Tg mice and correlated with their immunological phenotypes, TcR signaling and apoptosis capacity. Y126 is a newly identified regulatory, Y492 is an inhibitory, Y493 is a dominant activator residue in ZAP-70, therefore their loss-of-function (Y-F) mutations may have diverse effects on TcR signaling, apoptosis and disease (GIA) development.

Research question
Altered TcR signaling and impaired apoptosis mechanisms are thought to participate in the pathogenesis of RA; and the pathogenic role of ZAP-70 has been raised, therefore, our main question is: how is ZAP-70 kinase involved in the pathogenesis of GIA, a mouse model of RA. We hypothesize that ZAP-70-/- mice will not develop GIA due to the lack of functional T cells, but the restoration of the WT-ZAP-70 molecule should restore GIA. With the generation of Y-F mutant ZAP-70-Tg mice we will study the fine regulatory role of this kinase in GIA, paying special attention to arthritis susceptibility and severity. Immunophenotype, TcR signaling and apoptosis, and immune response against rhG1 of ZAP-70-/-, WT- or Y126F-, Y492F- and Y493F-ZAP-70-Tg mice will be studied in detail; and we will correlate these data with the clinical phenotypes.

Significance
This study will help us in understanding the role of ZAP-70 and T cell signaling in the pathogenesis of autoimmune arthritis. Using the newly generated Y126F-, Y492F- and Y493F mutant ZAP-70-Tg mice we could be the first to assess the effect of subtle genetically targeted signaling changes of a TcR signaling protein on the clinical outcome of arthritis. Thus, a fine molecular mechanism could be tested in a robust in vivo system leading to a better understanding of the role of T cell signaling in the pathomechanism of arthritis. Our project represents important basic immunological research with implications in a disease model.
Moreover, production of the above ZAP-70-Tg mice will provide powerful tools for studying a number of immunological questions such as T cell signaling, apoptosis and differentiation in different conditions and in different autoimmune models (in addition to autoimmune arthritis). Previous studies with other Y-F mutant ZAP-70-Tg mice have proved that such mutations have important immunological consequences in vivo.
Finally, GIA, a new mouse model of arthritis will be established in the Department of Immunology and Biotechnology. Based on the close collaboration between Prof. Dr. T. Glant (Rush University Medical Center, Chicago, IL, USA) and our laboratories we will be the second in the world to apply this autoimmune model in arthritis research; and the first in Hungary. Besides the specific aims of this proposal, this experimental system could be used for several research projects in the future.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
Beszereztük a ZAP-70 deficiens egereket a Jackson Laboratories-tól és visszakereszteztük BALB/c genetikai háttérre. Jellemeztük a homozigóta (teljesen ZAP-70 hiányos) és heterozigóta (részlegesen ZAP-70 hiányos) egerek perifériás nyirokszerveit és a thymusát. A homozigóta egerekben egyáltalán nincsenek érett αβ T sejtek, ami súlyos immundeficienciát okoz. Az immundeficiencia helyreállítására kidolgoztunk egy egyszerű adoptív transzfer módszert: vad-típusú egerek thymocytáit intraperitonealisan beadva a T sejt képzés normalizálódott és az egerek túlélése jelentősen meghosszabbodott. Beállítottuk laboratóriumunkben a rekombináns humán G1 (rhG1) indukált autoimmun arthritis modellt. A heterozigóta állatokban tesztelve a rhG1-indukált arthritisre megállapítottuk, hogy a betegség súlyossága csökkent, ami valószínűleg a csökkent T sejt aktivációnak és citokin termelésnek volt köszönhető. Homozigóta ZAP-70 KO egerekben sikerült T sejt specifikus módon helyreállítanunk a ZAP-70 expressziót csontvelői őssejtekbe történő lentivirális transzgén bevitellel. Továbbá létrehoztunk GFP reporter fehérjét T sejt specifikusan expresszáló transzgén egereket. Végül ZAP-70 KO BALB/c genetikai alapon Y-F pontmutációkat hordozó ZAP-70 transzgén egereket készítettünk lentivirális konstrukcióinkkal.
kutatási eredmények (angolul)
We purchased the ZAP-70 knockout mice from Jackson Laboratories and backcrossed them to BALB/c genetic background. We characterized the peripheral lymphoid organs and the thymus of homozygous (completely ZAP-70 deficient) and heterozygous (partially ZAP-70 deficient) mice. In homozygous mice there are no mature αβ T cells, which leads to severe immunodeficiency in them. To correct the immunodeficiency, we worked out a simple adoptive transfer method: we injected thymocytes isolated from wild-type mice intraperitoneally which normalized the T cell production and the survival of mice improved significantly. We established the recombinant human G1 (rhG1)-induced autoimmune arthritis model. When we tested the heterozygous mice for rhG1-induced arthritis we found decreased disease severity which could be the result of decreased T cell signaling and cytokine production. In homozygous ZAP-70 deficient mice we could succesfully restore the ZAP-70 expression in a T cell-specific manner by lentiviral gene delivery into hemopoetic stem cells. Furthermore, we generated such GFP transgenic mice in which the reporter gene expression is restricted to T cells. Finally, using our lentiviral constructs, we generated such transgenic mice on the ZAP-70 knockout BALB/c background which express Y-F point mutations in the ZAP-70.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=101493
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
A Hanyecz, K Olasz, O Tarjanyi, P Nemeth, K Mikecz, T T Glant, F Boldizsar: Proteoglycan Aggrecan Conducting T Cell Activation and Apoptosis in a Murine Model of Rheumatoid Arthritis, BIOMED RES INT 2014: , 2014
F. Boldizsar, K. Olasz, K. Kis-Toth, O. Tarjanyi, A. Hegyi, W. van Eden, T.A. Rauch, K. Mikecz, T.T. Glant: TcR signal dependent experimental arthritis in proteoglycan-specific TcR transgenic mice, Abstract#317, Eur J Clin Invest, Vol 42, Suppl.1, 2012
Boldizsár Ferenc, Tarjányi Oktávia, Olasz Katalin, Kis-Tóth Katalin, Mikecz Katalin, Glant Tibor: A TcR jelátvitel és apoptosis patogenetikai szerepe spontán arthritis modellben, Absztrakt #8, a 42. Membrán-Transzport Konferencia absztraktkönyvében, 2012
Olasz Katalin, Berki Tímea, Prenek Lilla, Németh Péter, Boldizsár Ferenc: T sejt rekonstitúciós vizsgálatok ZAP-70 deficiens egerekben, Absztrakt #10, a 43. Membrán-Transzport Konferencia absztraktkönyvében, 2013
Boldizsár Ferenc Szabó Mariann, Kohl Zoltán, Prenek Lilla, Kugyelka Réka, Németh Péter, Berki Tímea: THE ROLE OF ZAP-70 KINASE IN THE FINE-TUNING OF TCR SIGNALLING: IMPLICATIONS FOR IMMUNOPATHOLOGY AND –THERAPY, Immunológiai Szemle V(2): 6., A Magyar Immunológiai Társaság 42. Vándorgyűlésének összefoglalói, 2013
A. Hanyecz, K. Olasz, O. Tarjanyi, P. Nemeth, K. Mikecz, T. T. Glant, and F. Boldizsar: Proteoglycan Aggrecan Conducting T Cell Activation and Apoptosis in a Murine Model of Rheumatoid Arthritis, BioMed Research International, Volume 2014, Article ID 942148, 13 pages, 2014
Kugyelka Réka, Kohl Zoltán, Prenek Lilla, Németh Péter, Berki Tímea, Boldizsár Ferenc: A T sejt képzés helyreállításának kinetikai vizsgálata ZAP-70 deficiens egerekben, Absztrakt #6, a 44. Membrán-Transzport Konferencia absztraktkönyvében, 2014
Réka Kugyelka, Zoltán Kohl, Péter Németh, Timea Berki, Ferenc Boldizsár: STUDIES ON THE RECONSTITUTION OF T CELL PRODUCTION IN ZAP-70 DEFICIENT MICE, Immunológiai Szemle VI(3-4): 33, A Magyar Immunológiai Társaság 43. Vándorgyűlésének összefoglalói, 2014
Kugyelka Réka, Kohl Zoltán, Heeseung Sohn, Németh Péter, Berki Tímea, Boldizsár Ferenc: A ZAP-70 kináz részleges hiányának vizsgálata rheumatoid arthritis egér modellben, Absztrakt #38, a 45. Membrán-Transzport Konferencia absztraktkönyvében, 2015
Reka Kugyelka, Katalin Olasz, Zoltan Kohl, Sohn Hee Seung, Oktavia Tarjanyi, Peter Nemeth, Timea Berki, Ferenc Boldizsar: Analysis of partial ZAP-70 deficiency in a murine model of rheumatoid arthritis, Abstract#P.B.09.18, p117 in Abstracts of the 4th European Congress of Immunology - ECI 2015 - Vienna, Austria, 2015
Reka Kugyelka, Katalin Olasz, Zoltan Kohl, Sohn Hee Seung, Oktavia Tarjanyi, Peter Nemeth, Timea Berki, Ferenc Boldizsar: Investigation of ZAP-70 deficiency in a murine model of rheumatoid arthritis, Immunológiai Szemle VII(3):17., A Magyar Immunológiai Társaság 44. Kongresszusának összefoglalói, 2015
Reka Kugyelka, Zoltan Kohl, Katalin Olasz, Katalin Mikecz, Tibor A. Rauch, Tibor T. Glant, and Ferenc Boldizsar: Enigma of IL-17 and Th17 Cells in Rheumatoid Arthritis and in Autoimmune Animal Models of Arthritis, Mediators of Inflammation, Special Issue: Th17 Cytokines and Barrier Functions, Volume 2016 (2016), Article ID 6145810, 2016
Kugyelka Réka, Kohl Zoltán, Olasz Katalin, Prenek Lilla, Berki Tímea, Balogh Péter, Boldizsár Ferenc: Correction of T cell deficiency in ZAP-70 knock-out mice by simple intraperitoneal adoptive transfer of thymocytes, International Immunology (közlésre beküldve), 2017
Kugyelka Réka, Bender Balázs, Olasz Katalin, Kohl Zoltán, Balogh Péter, Berki Tímea, Boldizsár Ferenc: T sejt specifikus transzgén-expresszió vizsgálatok egér modellben, 46. Membrán-Transzport Konferencia absztraktkönyvében, 2016, 2016
Kugyelka Réka, Bender Balázs, Prenek Lilla, Olasz Katalin, Kohl Zoltán, Balogh Péter, Berki Tímea, Boldizsár Ferenc: INVESTIGATION OF T CELL-SPECIFIC TRANSGENE EXPRESSION IN MURINE MODELS, A Magyar Immunológiai Társaság 45. Kongresszusának összefoglalói, 2016, 2016
Boldizsár Ferenc, Kugyelka Réka, Bender Balázs, Balogh Péter, Kohl Zoltán, Olasz Katalin, Berki Tímea: T CELL-SPECIFIC RECONSTITUTION OF ZAP-70 IN MICE USING LENTIVIRAL GENE DELIVERY, A Magyar Immunológiai Társaság 45. Kongresszusának összefoglalói, 2016, 2016
Kugyelka R, Kohl Z, Olasz K, Mikecz K, Rauch TA, Glant TT, Boldizsar F: Enigma of IL-17 and Th17 Cells in Rheumatoid Arthritis and in Autoimmune Animal Models of Arthritis, MEDIAT INFLAMM : , 2016




vissza »