Az ErbB receptorok szignalizációs platformjainak kvantitatív karakterizálása és szerepük humán daganatokban  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
103906
típus K
Vezető kutató Nagy Péter
magyar cím Az ErbB receptorok szignalizációs platformjainak kvantitatív karakterizálása és szerepük humán daganatokban
Angol cím Quantitative characterization of ErbB receptor signaling platforms and their role in cancer
magyar kulcsszavak ErbB receptorok, receptor klaszterek, FRET, emlőtumor, lipid tutaj, receptor orientált daganat terápia
angol kulcsszavak ErbB receptors, receptor clusters, FRET, breast cancer, lipid raft, receptor-oriented cancer therapy
megadott besorolás
Általános biokémia és anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok)70 %
Ortelius tudományág: Molekuláris biológia
Sejtciklus és sejtosztódás (Orvosi és Biológiai Tudományok)20 %
Őssejtbiológia (Orvosi és Biológiai Tudományok)10 %
zsűri Molekuláris és Szerkezeti Biológia, Biokémia
Kutatóhely ÁOK Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet (Debreceni Egyetem)
résztvevők Batta Gyula
Szabó Ágnes Tímea
Váradi Tímea Erzsébet
projekt kezdete 2012-09-01
projekt vége 2016-08-31
aktuális összeg (MFt) 43.589
FTE (kutatóév egyenérték) 6.77
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

Az ErbB receptorok transzmembrán fehérjék, melyek mind nyugalmi, mind stimulált állapotban klasztereket alkotnak. A kutatási projekt keretén belül az ErbB3 homoklaszterizációját és a legfontosabb heterodimerek (ErbB1-2, ErbB2-3) összetételét fogjuk elemezni kvantitatív biofizikai módszerekkel (hetero-FRET, homo-FRET, number & brightness analízis, FRET-szenzitizált akceptor bleaching és quantum dot fluoreszcencia eloszlás analízis). Az asszociációk létrehozásában széleskörűen ismert extracelluláris domén mellett a transzmembrán szegmens szerepét, ill. a transzmembrán alfa-hélix konformációját befolyásoló dipól potenciál hatását is fogjuk vizsgálni. Az ErbB fehérjék asszociációit mind hagyományos sejtkultúrában, mind 3D kultúrában, ill. mesenchymális őssejtekkel történő együtt tenyésztés során is vizsgálni fogjuk. A kvantitatív biofizikai mérésekhez szükséges módszerek többsége már rendelkezésünkre áll, de a quantum dot fluoreszcencia eloszlás analízishez szükséges kiértékelő eljárást még ki kell dolgozni.
Szintén vizsgálni kívánjuk az ErbB szignalizációs hálózat kritikus működését, tehát azt, hogy fiziológiás körülmények között tényleg a kaotikus és a rendezett működés határán áll-e, mint sok más komplex biológiai rendszer. Ezenkívül megvizsgáljuk, hogy az ErbB fehérjék patológiás fokozott kifejeződése ezt a viselkedést mennyiben módosítja.
Végül az ErbB fehérjék asszociációit indirekten befolyásoló, a lipid tutajokon keresztül ható tumorellenes gyógyszer, az elisidepsin hatásait fogjuk vizsgálni. Ellenőrizzük, hogy a lipid környezet módosítása, ill. a lipid összetételt befolyásoló, a tumorokban gyakran előforduló hipoxia hogyan befolyásolja az elisidepsin hatékonyságát.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

-Feltételezzük, hogy az ErbB fehérjék szignalizációs képességeit alapvetően befolyásolja klaszterképződésük és a klaszterek pontos összetétele. Ezt csak kvantitatív biofizikai módszerekkel lehet meghatározni, ezért vizsgálataink során a még nem vizsgált ErbB3 homoklaszterek és a legfontosabb heterodimerek (ErbB1-2 és ErbB2-3) sztöchiometriáját fogjuk analizálni.
-Bár az ErbB fehérjék izolált transzmembrán szegmenseinek asszociációs hajlamát már kimutatták, a transzmembrán alfa hélix konformációját befolyásoló dipólpotenciál szerepét még nem vizsgálták. Vizsgálataink meg fogják mutatni a dipólpotenciál ErbB fehérjék asszociációjának szabályozásában betöltött szerepét.
-Bár számtalan tanulmány igazolta, hogy a membránfehérjék másképpen működnek monolayer és 3D kultúrákban, ezt a hatást még nem vizsgálták az ErbB fehérjéken. A vizsgálatok során az emlőtumor sejtek közötti sejt-sejt kölcsönhatások szerepét kívánjuk feltárni az ErbB fehérjék asszociációjában és szignáltranszdukciójában.
-Feltételezésünk szerint az ErbB receptorok által alkotott hálózat kritikus működést mutat, amely hozzájárul robosztusságához és flexibilitásához. Megvizsgáljuk, hogy ez tényleg így van-e fiziológiás ErbB receptor expresszió esetén, és hogy ebben milyen szerepe van az ErbB fehérjék expressziós szintjének.
-Feltételezzük, hogy az ErbB fehérjék klaszterizációját nemcsak a fehérjék tulajdonságai, hanem a lipid környezet is befolyásolja. Meg kívánjuk érteni, hogy az ErbB fehérjék asszociációit indirekten, a lipid tutajokon keresztül befolyásoló gyógyszer, az elisidepsin, hatását hogyan befolyásolják a lipid összetétel módosulásai, különösen tekintettel a tumorokban gyakran előforduló hipoxiára.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

1. Az ErbB fehérjék klaszterizációjának globális modelljének megalkotása. (a) A jelenleg uralkodó elképzelések alapvetően az extracelluláris domén által létrehozott homo-, ill. heterodimerekre fókuszálnak, bár világos, hogy a transzmembrán és intracelluláris domének is szerepet játszanak a klaszterizáció kialakításában, és az asszociációk nem állnak meg a dimerek szintjén, hanem magasabb rendű asszociátumok is kialakulnak. (b) A legtöbb vizsgálatban monolayer sejtkultúrában vizsgálják az ErbB fehérjék asszociációit. A tervezett 3D kultúrában történő vizsgálatok ezt a hiányt pótolják. (c) A klaszterek és az általuk kiváltott szignál transzdukciós folyamatok rendszerbiológiai („systems biology”) vizsgálata még nem történt meg. Várható, hogy fiziológiás és patológiás, fokozott expresszió mellett az ErbB szignalizációs hálózat eltérő mértékben mutatja a kritikus működés jeleit. Ez jelentősen befolyásolhatja azt, hogy egy lokális szignál milyen mértékben terjed ki, tehát milyen mértékben befolyásolja a környező ErbB fehérjék klaszterizációs és foszforiláltsági állapotát. Az a-c. pontokban várt eredmények jelentősen finomítani fogják az ErbB receptorcsalád klaszterizációs viselkedéséről alkotott elképzeléseinket.
2. Új módszert dolgozunk ki a membránfehérjék asszociációjának kvantitatív meghatározására, melyet quantum dot fluoreszcencia eloszlás analízisnek nevezünk. A módszer általunk kidolgozandó része a heteroasszociációk kvantitatív analízisére vonatkozik.
3. Malignus betegségek hatékonyabb kezelése. Bár a tervezett kutatási projekt alapvetően alapkutatás jellegű, két vonatkozásban is hozzájárulhat a rák jobb kezeléséhez. (a) Rámutat arra, hogy a nem daganatos és a rákos sejtek mennyiben különböznek a kritikus működés, és ezáltal a robosztusság, ill. flexibilitás tekintetében. A sejt szignalizációs hálózatának ezen paraméterek által meghatározott válaszát figyelembe kellene venni a kezelési protokollok kidolgozása során. (b) A hipoxia számtalan esetben gátja lehet a malignus tumorok hatékony sugár- és kemoterápiás kezelésének. Eredményeink egy konkrét esetben, az elisidepsin esetében, feltárhatják ennek mechanizmusát, és utat mutathatnak a rezisztencia legyőzésére.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média illetve az adófizetők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI számára.

A sejtek osztódását többek között ún. növekedési faktorok szabályozzák, melyek egyik típusa a sejtmembránban levő receptorokhoz kötődik. Az egyik legfontosabb ilyen faktor az epidermális növekedési faktor (epidermal growth factor, EGF), mely a sejtmembránban lévő receptorának (EGF receptor) dimerizációját váltja ki, de nagyobb méretű klaszterek is keletkeznek. Az EGF receptor egy család tagja, amiben a családtagok egymással sokféle homo- és heteroasszociátumot képesek kialakítani. A biológiai válasz meghatározásában ezen klaszterek összetétele kiemelkedően fontos. A tervezett vizsgálatokban a receptorok asszociációinak még nem ismert aspektusait fogjuk vizsgálni (kvantitatív összetétel, sztöchiometria). A kísérleteket háromdimenziós sejtkultúrában is elvégezzük, ahol a sejtek „életkörülményei” jobban hasonlítanak a testben tapasztalható viszonyokhoz, mint a legtöbb hagyományos vizsgálatban.
Talán meglepő, de a legtöbb összetett biológiai rendszer nem teljesen rendezett, hanem matematikai értelemben kaotikus működés jeleit mutatja. Pontosabban a rendezett és rendezetlen (kaotikus) viselkedés határán vannak, amit kritikus működésnek nevezünk. Ez fontos a rendszer stabilitása és alkalmazkodó képessége szempontjából. A tervezett vizsgálatokban összehasonlítjuk, hogy az egészséges és daganatos sejtek mennyiben különböznek ebben a tekintetben. Ez abban is segítségünkre lehet a jövőben, hogy jobban megértsük a daganatos sejtek kemoterápiás kezelésre adott válaszát.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

ErbB receptors are transmembrane proteins clustered both in quiescent and stimulated cells. In the current research proposal we will investigate the homoclustering of ErbB3 and the stoichiometry of the most important heterodimers (ErbB1-2 and ErbB2-3) using quantitative biophysical methods (hetero-FRET, homo-FRET, number & brightness analysis, FRET-sensitized acceptor bleaching and quantum dot fluorescence distribution analysis). Besides the widely known extracellular domain we will evaluate the role of the transmembrane segment, and the dipole potential-induced alterations in the conformation of the transmembrane alpha helix, in the regulation of ErbB protein clustering. Associations of ErbB proteins will be analyzed in conventional monolayers and in 3D cell cultures as well as in co-cultures of breast cancer cells with mesenchymal stem cells. Most of the methods required to perform the biophysical measurements are already available, but the evaluation protocol for the quantum dot fluorescence distribution analysis will have to be worked out.
We will also investigate the criticality of the ErbB signaling network, i.e. whether the system indeed stands at the border of chaotic and organized behavior under physiological conditions similar to many complex biological systems. In addition, we will check whether pathological overexpression of ErbB proteins alters this type of behavior.
In the end we will look at the effects of a novel anti-tumor compound, elisidepsin, known to modify ErbB protein clustering indirectly via lipid rafts. We will investigate how alterations in the lipid environment and hypoxia-induced lipid modifications change the efficiency of elisidepsin.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

-We assume that the signaling potential of ErbB proteins is determined by their cluster formation and by the exact composition of clusters. These questions can only be answered by quantitative biophysical tools, therefore we will explore the composition of ErbB3 homoclusters and the most important heteroclusters (ErbB1-2,ErbB2-3) which have not been investigated so far.
-Although the association propensity of isolated transmembrane segments of ErbB proteins has already been demonstrated, the role of the dipole potential, known to alter the conformation of transmembrane alpha helices, has not been investigated. Our experiments will elucidate the role of the dipole potential in regulating ErbB protein clusters.
-Although several studies reported that membrane proteins behave differently in monolayer and 3D cultures, this phenomenon has not been demonstrated for ErbB proteins. We will analyze the role of cell-cell contacts in the regulation of ErbB protein associations and transmembrane signaling.
-We assume that the ErbB signaling network shows criticality which is essential to its robustness and flexibility. We will investigate whether this is indeed so, and what role the expression level of ErbB proteins has in these observations.
-We assume that ErbB protein clustering is not only influenced by the properties of the proteins themselves, but also by the lipid milieu. We would like to understand how the effectivity of a drug, elisidepsin, known to affect the clustering of ErbB receptors indirectly via lipid rafts, is influenced by alterations in the lipid composition of the membrane with special attention paid to the effect of hypoxia often present in malignant tumors.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

1. Generation of a global model for the clustering of ErbB proteins. (a) The currently prevailing view focuses on extracellular domain-driven formation of homo- and heterodimers, although it has been shown that the transmembrane and intracellular domains also play a role, and that clusters are not limited to dimers, but higher-order associations are also present. (b) In most investigations ErbB protein clustering is analyzed in monolayer cultures. The planned investigations carried out in 3D cultures will fill this gap. (c) The systems biological investigation of ErbB clusters and their signals has not been carried out. It is foreseen that the ErbB signaling network exhibits features of criticality to different extents under physiological and pathological conditions. This will significantly influence how far a local signal will spread, i.e. to which extent it will modify the state of clustering and phosphorylation of neighboring ErbB receptors. Results expected under points a-c will significantly refine our views about the clustering behavior of ErbB proteins.
2. We will develop a new method for the quantitative analysis of receptor clustering termed quantum dot fluorescence intensity distribution analysis. The part we undertake to work out pertains to the investigation of heteroclusters.
3. Better treatment of malignant diseases. Although the proposed project is of basic research character, it can contribute to the more efficient treatment of cancer. (a) It will point out how non-malignant and cancer cells differ with respect to critical behavior, robustness and flexibility. The response of the cell’s signaling network determined by the above parameters should be taken into account when devising treatment protocols. (b) Hypoxia prevents the efficient chemotherapeutic and radiation treatment of malignant tumors. Our results may elucidate the mechanism of this phenomenon in the case of elisidepsin, a novel chemotherapeutic drug, and could point to potential ways to tackle resistance.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NKFI in order to inform decision-makers, media, and the taxpayers.

Among others cell division is regulated by growth factors. One class of such growth factors binds to cell surface receptors. One of the most important such factors is the epidermal growth factor (EGF) which induces the dimerization of its cell membrane receptor, EGF receptor. In addition to dimers, higher-order associations also arise. The EGF receptor belongs to a family in which family members form a huge diversity of homo- and heteroassociations with each other. The composition of such clusters is important in the determination of the biological response. In the proposed research project we will investigate the unknown features (quantitative composition, stoichiometry) of these associations. The experiments will be carried out in three-dimensional cell cultures in which the conditions resemble the in vivo environment more closely than in most conventional investigations.
It may sound strange but most biological system are not fully ordered or organized. Instead, they show features of chaotic behavior in the mathematical sense. More specifically, such systems are on the border of organized and disorganized (chaotic) behavior, a feature called criticality, which is important for the stability and adaptability of the system. In the proposed investigations we will compare how healthy and malignant cells differ from each other in this respect. The results may help us better understand how cancer cells respond to chemotherapeutic treatments.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
A kutatás célja az ErbB receptorok klaszterizációja és funkciója közötti kapcsolat jobb megértése volt. Az ErbB fehérjék az epidermális növekedési faktor (EGF) és a heregulin (HRG) receptorai. Megállapítottuk, hogy az ErbB3 (HRG receptor) ligand független dimereket alkot, és a dimerfrakció növekszik HRG stimulációt követően, amit az ErbB3 csökkent laterális mobilitása kísér. Az ErbB1 (EGF receptor) és az ErbB2 homoasszociációjában, a két fehérje heteroasszociációjában valamint aktivációjukban az EGF által előidézet növekedést a membrán dipólpotenciálja elősegíti, annak ellenére, hogy a dipólpotenciál növelése az EGF kötődését csökkenti. Az ErbB2 ligand indukált tirozin foszforilációja elsősorban a lipid tutajokon kívül következik be. Emlőtumor sejtekben az ErbB1 tirozin foszforilációja és az Akt aktivációja jelentős mértékben csökkent, míg azErbB2 homoasszociációja növekedett háromdimenziós (3D) sejtkultúrában a hagyományos körülményekhez képest, azonban a Ras-MAPK útvonal aktivációjában nem tapasztaltunk különbséget. A 3D sejtkultúrában tapasztalt változásokhoz hasonló hatást kaptunk jelátviteli kaszkádok tekintetében akkor is, ha az emlőtumor sejteket mesechymális őssejtek kondicionált médiumával kezeltük. A lipid tutajokhoz (folyadék rendezett fázis) kötődő elisidepsin kísérleti kemoterapikumról kimutattuk, hogy hypoxiás körülmények között kisebb hatást fejt ki, mert csökken a gyógyszer számára kötőhelyként viselkedő hidroxilált lipidek szintje.
kutatási eredmények (angolul)
The major aim of the research program was to elucidate the relationship between the clustering of ErbB receptors and their function. ErbB proteins are receptors for epidermal growth factor and heregulin (HRG). We have shown that ErbB3, the receptor for HRG, forms constitutive ligand-independent dimers whose fraction increases upon HRG stimulation accompanied by reduced diffusion rate of ErbB3. The ligand-induced increase in the homoclustering of ErbB1 (also known as EGF receptor) and ErbB2, their heteroassociation and activation are enhanced by the membrane dipole potential although the binding of EGF to its receptor is inhibited. The ligand-induced tyrosine phosphorylation of ErbB2 preferentially takes place outside lipid raft regions. The tyrosine phosphorylation of ErbB1 and the activation of Akt was significantly reduced, whereas the homoassociation of ErbB2 increased in three-dimensional (3D) cell cultures compared to conventional, 2D cultures, while no difference was observed in the activation of the Ras-MAPK pathway. Similar effects were detected regarding the signaling cascades when breast cancer cells were cultured in the presence of media conditioned with mesenchymal stem cells. We have shown that elisidepsin, an experimental chemotherapeutic drug binding to lipid rafts (liquid order domains) exerts reduced effects under hypoxic conditions due to the reduced level of hydroxylated lipids, the binding sites of elisidepsin.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=103906
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
Tamás Kovács, Gyula Batta, Tímea Hajdu, Ágnes Szabó, Tímea Váradi, Florina Zákány, István Csomós, János Szöllősi, Peter Nagy: The Dipole Potential Modifies the Clustering and Ligand Binding Affinity of ErbB Proteins and Their Signaling Efficiency, Scientific Reports, accepted for publication, 2016
Anna Király, Tímea Váradi, Tímea Hajdu, Ralph Rühl, Carlos M. Galmarini, János Szöllősi, Péter Nagy: Hypoxia reduces the efficiency of elisidepsin by inhibiting hydroxylation and altering the structure of lipid rafts., Marine Drugs, 11:4858-4875., 2013
Maria-Magdalena Mocanu, Constanta Ganea, Laura Georgescu, Tímea Váradi, Dilip Shrestha, Irina Baran, Eva Katona, Péter Nagy, János Szöllősi: Epigallocatechin 3-O-gallate induces 67 kDa laminin receptor-mediated cell death accompanied by downregulation of ErbB proteins and altered lipid raft clustering in mamma, Journal of Natural Products, 77:250-257., 2014
Péter Nagy, Ágnes Szabó, Tímea Váradi, Tamás Kovács, Gyula Batta, János Szöllősi: Maximum likelihood estimation of FRET efficiency and its implications for distortions in pixelwise calculation of FRET in microscopy, Cytometry A, in press, 2014
Enikő Nizsalóczki, István Csomós, Péter Nagy, Zsolt Fazekas, Carolyn K. Goldman, Thomas A. Waldmann, Sándor Damjanovich, György Vámosi, László Mátyus, Andrea Bodnár: Distinct spatial relationship of interleukin-9 receptor with IL-2R and MHC glycoproteins in human T lymphoma cells, ChemPhysChem, in press, 2014
Enikő Nizsalóczki, István Csomós, Péter Nagy, Zsolt Fazekas, Carolyn K. Goldman, Thomas A. Waldmann, Sándor Damjanovich, György Vámosi, László Mátyus, Andrea Bodnár: Distinct spatial relationship of interleukin-9 receptor with IL-2R and MHC glycoproteins in human T lymphoma cells, ChemPhysChem, 15, 3969 – 3978, 2014
Dilip Shrestha, Attila Jenei, Péter Nagy, György Vereb, János Szöllősi: Understanding FRET as a research tool for cellular studies, Int. J. Mol. Sci., 2015
Maria-Magdalena Mocanu, Péter Nagy, János Szöllősi: Chemoprevention of Breast Cancer by Dietary Polyphenols, Molecules, 20: 22578-22620., 2015
Peter Nagy, Ágnes Szabó, Tíımea Váradi, Tamás Kovács, Gyula Batta, János Szöllősi: rFRET: A comprehensive, Matlab-based program for analyzing intensity-based ratiometric microscopic FRET experiments, 89A: 376-384, 2016
Gábor Mocsár, Julianna Volkó, Daniel Rönnlund, Jerker Widengren, Peter Nagy, János Szöllősi, Katalin Tóth, Carolyn Goldman, Sándor Damjanovich, Thomas A. Waldmann, Andrea Bodnár, György Vámosi: MHC I Expression Regulates Co-clustering and Mobility of Interleukin-2 and -15 Receptors in T Cells, Biophyical Journal, 111, 100–112, 2016
János Szöllősi, György Vereb, Peter Nagy: The flow of events: how the sequence of molecular interactions is seen by the latest, user friendly high throughput flow cytometric FRET, Cytometry, Accepted for publication, 2016





 

Projekt eseményei

 
2014-04-06 16:27:37
Résztvevők változása
2013-11-19 19:56:57
Résztvevők változása




vissza »