Az Ncb5or flavohem reduktáz szerepe a zsírsav deszaturációban és a metabolikus szindróma kialakulásában  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
104113
típus PD
Vezető kutató Kereszturi Éva
magyar cím Az Ncb5or flavohem reduktáz szerepe a zsírsav deszaturációban és a metabolikus szindróma kialakulásában
Angol cím The role of Ncb5or flavoheme reductase in fatty acid desaturation and in development of the metabolic syndrome
magyar kulcsszavak Ncb5or, Scd1, metabolikus szindróma, redox homeosztázis, zsírsav deszaturáció
angol kulcsszavak Ncb5or, Scd1, metabolic syndrome, redox homeostasis, fatty acid desaturation
megadott besorolás
Biológiai rendszerek elemzése, modellezése és szimulációja (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)80 %
Általános biokémia és anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)20 %
Ortelius tudományág: Molekuláris biológia
zsűri Molekuláris és Szerkezeti Biológia, Biokémia
Kutatóhely Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Patobiokémiai Intézet (Semmelweis Egyetem)
projekt kezdete 2012-09-01
projekt vége 2017-08-31
aktuális összeg (MFt) 10.384
FTE (kutatóév egyenérték) 2.10
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

A metabolikus szindróma a szénhidrát és lipid anyagcsere együttes zavara, mely a fejlett és a fejlődő országok lakosságának mintegy negyedét érinti. A betegség tünetei (elhízás, magas triglicerid- és koleszterinszint, inzulinrezisztencia) és következményei (szív és érrendszeri megbetegedések, diabetes) egyértelműek, azonban sem a pontos patomechanizmus, sem a megfelelő kezelés nem ismert. A kórkép kandidáns fehérjéje a sztearil-KoA-deszaturáz 1, mely a telítetlen zsírsavak szintézisének kulcsenzime. Hipotézisünk szerint a reakcióhoz szükséges redukáló erőt az elmúlt évtizedben leírt, a metabolikus szindrómával egyértelmű kapcsolatban álló, de funkcionális szempontból nem jellemzett flavohem reduktáz, az Ncb5or biztosítja.
Célok:
1. Az Ncb5or funkcionális vizsgálata. Vizsgálni kívánjuk, hogy (i) az Ncb5or intracelluláris fehérjeszintjének szabályozásában milyen módon játszik szerepet az ubikvitináció és az azt követő degradáció, illetve (ii) a sejten belüli lebomlás mértéke függ-e a fehérje hemkötő kapacitásától.
2. Az Ncb5or intracelluláris lokalizációjának vizsgálata. Az Ncb5or sejten belüli helyzete máig bizonytalan. A fehérje intracelluláris lokalizációjának pontos ismerete azonban elengedhetetlen az enzim működésének, funkciójának pontos felderítéséhez.
3. Az Scd1 és az Ncb5or fehérjék kapcsolatának elemzése. A fehérje zsírsav deszaturációban betöltött szerepének bizonyítása nagyban hozzájárulhat a metabolikus szindróma patomechanizmusának megismeréséhez. Ezért az Scd1 és az Ncb5or fehérjék fizikai (immunhisztokémai, immunprecipitációs, AlphaScreen módszerek) és funkcionális (enzimaktivitás mérések) kapcsolatát egyaránt tervezzük vizsgálni in vitro és in vivo.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

Jelen kutatási terv alapkérdése az Ncb5or, egy újonnan leírt flavohem reduktáz, funkciójának, szabályozásának, lokalizációjának, valamint a zsírsav deszaturációban betöltött szerepének vizsgálata. Az a tény, hogy az Scd1 a metabolikus szindróma egyik alapvető kandidáns génje, valamint az, hogy az Ncb5or deficiens egereket a metabolikus szindróma tünetei és a telítetlen zsírsavak akkumulációja jellemzi, felveti a két fehérje közötti funkcionális kapcsolat lehetőségét.
Az alapkérdést a következő kutatási feladatok elvégzésével tervezzük megválaszolni:
1. Az SCD1 és az NCB5OR géneket az elvégzendő feladatnak megfelelő epitóp címkével különböző expressziós vektorokba klónozzuk.
2. Kidolgozzuk az Scd1 és az Ncb5or fehérjék expressziójának módszerét mind sejtvonalakon, mind pedig in vitro, sejtmentes transzlációs rendszerben.
3. Megvizsgáljuk az Ncb5or hemkötő kapacitását.
4. Meghatározzuk az Ncb5or pontos intracelluláris lokalizációját.
5. Megvizsgáljuk az Ncb5or lehetséges ubikvitnációs helyeit, degradációjának sebességét.
6. Bizonyítjuk az Scd1 és az Ncb5or fehérjék fizikai és funkcionális kapcsolatát in vitro és in vivo.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

A tervezett kutatás várható eredményei mind orvosi, mind biokémiai, mind pedig molekuláris biológiai szempontból jelentőséggel bírnak. Munkánk során vizsgáljuk a nemrég leírt oxidoreduktáz enzim (Ncb5or) funkcióját, bizonyíthatjuk együttműködését a lipid deszaturációt végző Scd1 enzimmel. A két fehérje esetleges összehangolt működése az endoplazmás retikulum luminális redox állapotának lipid metabolizmusra gyakorolt közvetlen hatását is bizonyítja, valamint alátámasztja a sejtorganellum nutriens szenzor funkcióját. Várható eredményeink fényt deríthetnek a lipid metabolizmus és a redox homeosztázis közötti egyértelmű kapcsolatra, amely hozzájárulhat az elhízással kapcsolatos anyagcsere betegségek jobb megértéséhez. Az Scd1 és az Ncb5or enzimek az ER luminális redox homeosztázisával együtt rendkívül ígéretes gyógyszer támadási pontok, így a kutatásaink során szerzett ismeretek új, hatékony preventív és terápiás protokollok alapjául szolgálhatnak mind metabolikus szindrómában, mind diabetes mellitusban.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média illetve az adófizetők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI számára.

Az elhízás talaján kialakuló metabolikus szindróma, mely inzulin rezisztenciával és a 2-es típusú cukorbetegség jelentős kockázatával jár, emberek millióit érintő népbetegség. Pontos patomechanizmusa máig tisztázatlan. A tünetegyüttes vizsgálata során növekvő figyelem irányul a vérben megemelkedett zsírsavszint káros hatásainak felderítésére. A telítetlen zsírsavak szintézisét nagyrészt az endoplazmás retikulum (ER) membránjában elhelyezkedő sztearil-KoA-deszaturáz 1 (Scd1) végzi. Hipotézisünk szerint az ezen folyamathoz szükséges ún. redukáló molekulákat egy nemrég felfedezett enzim, az Ncb5or biztosíthatja, mely feltehetően az ER lumenében lokalizálódik. Az NCB5OR génkiütött fiatal egerekben a metabolikus szindróma jellegzetes tünetei mutatkoznak, majd idősebb állatokban cukorbetegség alakul ki, ezen kívül májukban jelentősen megnő a telítetlen zsírsavak aránya. Ez utóbbi megfigyelés felveti az Ncb5or szerepét a telítetlen zsírsavak létrehozásában. Hipotézisünk bizonyítására molekuláris biológiai és biokémiai alapokon nyugvó kísérleteket tervezünk elvégezni. Többek között tisztázzuk az Ncb5or tényleges sejten belüli elhelyezkedését, lebomlását, hemkötő képességét. Ezen kívül vizsgáljuk az Ncb5or és az Scd1 fehérjék fizikai és funkcionális kapcsolatát. Enzimaktivitás méréseket tervezünk beállítani mind az Scd1, mind az Ncb5or esetében, ami a későbbiekben lehetőséget adhat a természetes variánsok funkcionális jellemzésére is. Várható eredményeink hozzájárulhatnak a metabolikus szindróma patológiai folyamatainak megértéséhez, azok megállításához, ezáltal csökkenthető a 2-es típusú cukorbetegség illetve szövődményeinek kockázata.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

The metabolic syndrome is characterized by abnormalities in carbohydrate and lipid metabolism and affects one fourth of the population in developed and developing countries. Although, symptoms (obesity, high triglyceride and serum cholesterol concentration, insulin resistance) and consequences (cardiovascular diseases, diabetes) of the syndrome are well-known, neither the pathomechanism, nor the proper treatment has been resolved. The candidate protein of the disease is the Stearoyl-CoA desaturase 1; the rate limiting enzyme in unsaturated fatty acid synthesis. Based on our hypothesis, the reducing force needed for desaturation is provided by Ncb5or, a recently described, functionally poorly characterized flavoheme reductase.
Key goals:
1. Functional analysis of Ncb5or. We plan to study (i) if the Ncb5or protein level is regulated by ubiquitination and degradation, and (ii) if the speed of intracellular degradation is dependent on the heme binding capacity of the enzyme.
2. Investigation of intracellular localization of Ncb5or. The intracellular localization of Ncb5or is not unambiguously resolved yet. Nevertheless, the exact localization of the enzyme is necessary to be confirmed to deeply understand its function.
3. Relationship between Scd1 and Ncb5or. Demonstration and analysis of the role of Ncb5or in unsaturated fatty acid synthesis might support the understanding of the pathomechanism of metabolic syndrome. Thus, we plan to study both the physical (by immunohistochemistry, immunoprecipitation and AlphaScreen based methods) and the functional (enzyme activity measurements) connection between Scd1 and Ncb5or in vitro and in vivo.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

The main purpose of the present research project is to investigate and understand the function, regulation, localization of Ncb5or and its possible role in fatty acid desaturation, hence in the development of metabolic syndrome. The facts that Scd1 is associated with metabolic syndrome; as well as Ncb5or knock-out mice indicates unambiguous diabetic symptoms and elevated unsaturated fatty acid accumulation in the liver, together with the unclear ER associated localization of Ncb5or raise the possibility of the functional relation between the two proteins.
The research question is planned to be resolved by the following experiments:
1. Molecular cloning of wild type, mutant and differently epitope tagged versions of SCD1 and NCB5OR genes into different expression vectors.
2. Elaboration of in vitro cell-free translational and human cell line based protein expression methods for both enzymes.
3. Analysis of heme binding capacity of Ncb5or and its naturally occurring variants.
4. Clarification of the intracellular localization of Ncb5or.
5. Analysis of ubiquitination sites and degradational rate of Ncb5or.
6. Investigation of the physical and functional connection between Scd1 and Ncb5or protein in vitro and in vivo.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

The expected findings of the planned research are equally important from medical, biochemical and molecular biological aspects. Our results would reveal the role of a novel oxidoreductase enzyme (Ncb5or) and its co-operation with lipid desaturating Scd1. The presumable compartmentation of their concerted action would also provide evidence for the role of ER luminal redox state in lipid metabolism, and hence would further support the concept of the nutrient sensor function of the organelle. Our expected results would resolve a definite link between lipid metabolism and redox homeostasis, which can improve the understanding of obesity related metabolic disorders. The components (Ncb5or, Scd1, ER luminal redox state) are all potential drug-targets; and hence the collected data can serve grounds for the elaboration of new efficient preventive and therapeutic protocols in the metabolic syndrome and diabetes mellitus.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NKFI in order to inform decision-makers, media, and the taxpayers.

Metabolic syndrome is a major risk factor for insulin resistance and type 2 diabetes mellitus and affects millions of people, its patomechanism is however not yet clarified. Special attention has recently been focused on the identification of pathological effects of high systemic lipid levels in metabolic syndrome. Generation of unsaturated fatty acids is mostly catalyzed by stearyl-CoA desaturase 1 (Scd1) localized in the membrane of the endoplasmic reticulum (ER). Based on our hypothesis, NADPH for the reaction is provided by the Ncb5or, which is also localized in the ER, and has only recently been described. The Ncb5or knock-out mice carry the characteristic symptoms of metabolic disease, moreover, in adult animals diabetes mellitus together with unsaturated fatty acid accumulation in the liver are also developed. These observations raise the possibility of the role of Ncb5or in unsaturated fatty acid synthesis. To confirm our hypothesis, several molecular biological and biochemical experiments are proposed. On one hand, the intracellular localization, degradation and heme binding capacity of Ncb5or will be clarified. On the other hand, physical and functional connection between Ncb5or and Scd1 will be analyzed. We plan to elaborate appropriate enzyme activity measurements for both proteins, which will provide an adequate tool for functional characterization of naturally occurring variants. Our results might support the understanding of the background of metabolic syndrome, and consequently the elaboration of efficient therapeutic protocols, which would help to decrease the risk of type 2 diabetes.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
A metabolikus szindróma a szénhidrát és lipid anyagcsere együttes zavara, mely a fejlett és a fejlődő országok lakosságának mintegy negyedét érinti. A betegség tünetei és következményei egyértelműek, azonban a pontos patomechanizmus és a megfelelő kezelés nem ismert. A kórkép kandidáns fehérjéje a sztearil-KoA-deszaturáz 1, mely a telítetlen zsírsavak szintézisének kulcsenzime. Hipotézisünk szerint a reakcióhoz szükséges redukáló erőt a metabolikus szindrómával egyértelmű kapcsolatban álló, de funkcionális szempontból nem jellemzett flavohem reduktáz, az Ncb5or biztosítja. A kutatómunka során azonosítottunk két olyan természetesen előforduló Ncb5or variánst (p.E87G, p.E93G), melyek a sejtben rendkívül gyorsan lebomlanak. A mutációk a hem-kötő régió közvetlen közelében találhatók, azok térszerkezetét befolyásolva változathatják a fehérje féléletidejét. Ezen kívül az Ncb5or sejten belüli bizonytalan lokalizációját is tisztáztuk. Több módszerrel bizonyítottuk, hogy ez a szolubilis fehérje a citoszolban található, szemben a korábban feltételezett ER lokalizációval. Végül vizsgáltuk az Ncb5or és az Scd1 kapcsolatát. Számos módszert kidolgoztunk ezen fehérjék és variánsaik in vitro (in vitro transzláció) és in vivo (bakteriális rendszerek) termelésére és tisztítására. Valamint sikerült beállítani egy érzékeny GC-FID alapú módszert a deszaturációs reakció során keletkező telítetlen zsírsavak rutinszerű mérésére.
kutatási eredmények (angolul)
The metabolic syndrome is characterized by abnormalities in carbohydrate and lipid metabolism and affects one fourth of the population in developed and developing countries. Although, symptoms and consequences of the syndrome are well-known, neither the pathomechanism, nor the proper treatment has been resolved. The candidate protein of the disease is the Stearoyl-CoA desaturase 1; the rate limiting enzyme in unsaturated fatty acid synthesis. Based on our hypothesis, the reducing force needed for desaturation is provided by Ncb5or, a recently described, functionally poorly characterized flavoheme reductase. During the research project, two naturally occurred Ncb5or variants were identified (p.E87G, p.E93G), which were characterized by rapid intracellular degradation. The mutations are located near by hem-binding region of the protein, influencing its 3D structure and the half-life of the enzyme. The unsure intracellular localization of Ncb5or was also clarified. In opposite to the previously supposed ER localization, this protein was demonstrated to be localized in cytosol by independent methods. We analyzed the connection between Ncb5or and Scd1. Several methods were elaborated to produce in vitro (in vitro translation) and in vivo (bacterial production) and purify this proteins and their variants. Furthermore, a highly sensitive GC-FID based technique was elaborated to measure properly unsaturated fatty acids produced by desaturational reaction.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=104113
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
Kálmán FS, Lizák B, Nagy SK, Mészáros T, Zámbó V, Mandl J, Csala M, Kereszturi E: Natural mutations lead to enhanced proteasomal degradation of human Ncb5or, a novel flavoheme reductase, Biochimie. 2013 Jul;95(7):1403-10., 2013
Szelényi P, Révész K, Konta L, Tüttõ A, Mandl J, Kereszturi E, Csala M: Inhibition of microsomal cortisol production by (-)-epigallocatechin-3-gallate through a redox shift in the endoplasmic reticulum-A potential new target for treating obes, Biofactors. 2013 Mar 29., 2013
Zámbó V, Simon-Szabó L, Szelényi P, Kereszturi E, Bánhegyi G, Csala M.: Lipotoxicity in the liver, World J Hepatol. 2013 Oct 27;5(10):550-7., 2013
Zámbó V, Tóth M, Schlachter K, Szelényi P, Sarnyai F, Lotz G, Csala M, Kereszturi É: Cytosolic localization of NADH cytochrome b₅ oxidoreductase (Ncb5or), FEBS Lett. 2016 Mar;590(5):661-71., 2016




vissza »