A GAP43-kalmodulin kölcsönhatás szabályozása a szfingozin és lizofoszfatidsav jelátviteli lipidekkel  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
104344
típus PD
Vezető kutató Juhász Tünde
magyar cím A GAP43-kalmodulin kölcsönhatás szabályozása a szfingozin és lizofoszfatidsav jelátviteli lipidekkel
Angol cím Control of the growth associated protein 43 - calmodulin interaction by the signalling lipids sphingosine and lysophosphatic acid
magyar kulcsszavak GAP43, kalmodulin, jelátvitel, mediátor lipid, fehérje-lipid kötődés
angol kulcsszavak GAP43, calmodulin, signalling, lipid mediator, protein-lipid binding
megadott besorolás
Általános biokémia és anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok)50 %
Ortelius tudományág: Biokémia
Jelátvitel (Orvosi és Biológiai Tudományok)35 %
Szerkezeti biológia (krisztallográfia és elektronmikroszkópia) (Orvosi és Biológiai Tudományok)15 %
zsűri Molekuláris és Szerkezeti Biológia, Biokémia
Kutatóhely Enzimológiai Intézet (MTA Természettudományi Kutatóközpont)
projekt kezdete 2012-09-01
projekt vége 2015-08-31
aktuális összeg (MFt) 20.856
FTE (kutatóév egyenérték) 2.70
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

Az agyban nagy mennyiségben előforduló GAP43 foszfofehérjének alapvető fontosságot tulajdonítanak az axonok növekedésének, a szinaptikus plaszticitásnak és a neuroregenerációnak a szabályozásában, ugyanakkor működését molekuláris szinten kevéssé értjük. Hatását valószínűleg az aktinváz helyi szabályozásán át fejti ki, miközben működését a Ca2+-szint több módon befolyásolja. A kalmodulin (CaM) az eukarióta sejtek általános Ca2+-szenzora, számos jelátviteli fehérje aktivitását szabályozza. Ismert, hogy a GAP43 és a CaM komplexet képez egymással, melyről feltételezik, hogy a membránhoz kötődik. A jelátviteli folyamatokban feldúsuló lipidekkel kialakított kölcsönhatások szabályozhatják mindkét fehérje molekuláris állapotát, ezzel együtt működését. Nemrégiben azt találtuk in vitro kísérleteinkben, hogy a jelátvitelben szerepet játszó szfingozin (Sph) kötődik a CaM-hoz, míg egy másik mediátor lipid, a lizofoszfatidsav (LPA) a GAP43-hoz. Célul tűztük ki, hogy biokémiai és biofizikai módszerekkel részletesen jellemezzük a GAP43–CAM–Sph–LPA négytagú rendszer kölcsönhatásait in vitro, vizsgálva a Ca2+-szint és a GAP43 foszforilációjának hatását is. Fel kívánjuk tárni az in vitro eredmények in vivo jelentőségét, köztük bizonyítani a CaM Sph általi direkt gátlását, humán sejtvonalakon végzett kísérletekkel, immunkémiai módszereket használva. Tervezzük a CaM-Sph komplex kristályszerkezetének meghatározását is. Eredményeinkkel jelentősen hozzájárulhatunk a sejtszintű jelátviteli folyamatok összefüggéseinek alaposabb megértéséhez, valamint a lipid-fehérje kölcsönhatásokat szervező szerkezeti és működésbeli tényezők feltárásához.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

Jelen kutatás középpontjában egy intenzíven kutatott és nagy fontossággal bíró jelátviteli terület áll: vajon képesek-e szabályozni a LPA és a Sph jelátvivő lipidek a GAP43-CaM kölcsönhatást az idegvégződésekben. Jelenleg nem tisztázott melyik partner-fehérje szabályozza a másikat és hogyan befolyásolják a membránhoz kapcsolódó komplex képződését mikrokörnyezeti faktorok, mint a magában a membránban keletkező jelátvivő lipidek. A GAP43-CaM-LPA-Sph alkotta két szignálfehérjéből és két jelátviteli lipidből álló rendszer kölcsönhatási viszonyainak feltárása mind a négy komponenssel kapcsolatban szolgáltat információt molekuláris állapotuk, ezzel együtt funkciójuk szabályozásával kapcsolatban.
Eredményeink a következő területeken járulnak hozzá ismereteink bővüléséhez:
(i) milyen új kölcsönhatások szabályozzák az axonok növekedését,
(ii) a Sph és a LPA intracelluláris célfehérjéinek természete,
(iii) a Sph mint a CaM endogén inhibitorának jellemzése,
(iv) a lipidekkel ill. a kalcium részvételével zajló jelátviteli folyamatok kapcsolata,
(v) a lipid-fehérje kölcsönhatások szerkezeti és funkcionális jellemzése,
(vi) a rendezetlen GAP43 szerkezeti rendeződésének szerepe működésében,
(vii) a GAP43 oligomerizációjának funkcionális következményei.
Sejtvonalakon végzett kísérletekkel megpróbáljuk igazolni in vitro eredményeink in vivo fontosságát is.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

Két élettanilag fontos fehérje, a GAP43 és a CaM kölcsönhatását kimutatták in vitro és in vivo is, ám annak jellege és következményei vitatottak. A GAP43 meghatározó az axonok növekedésének szabályozásában, a szinaptikus plaszticitásban és a neuroregenerációban. A CaM a kalcium-jelátvitel elsődleges közvetítő fehérjéje. Együttes jelenlétüket megfigyelték az idegvégződésekben és komplexük membránhoz kapcsolódását is feltételezik. Mindazonáltal nem világos, vajon a CaM szabályozza a GAP43 aktivitását, vagy a GAP43 irányítja a CaM hozzáférhetőségét. Valószínűsíthető, hogy a komplex mikrokörnyezetében lévő faktorok befolyásolják az azt alkotó fehérjék lokalizációját és működését. Projektünkben két jelátvivő lipid szerepét vizsgáljuk meg a GAP43-CaM kölcsönhatás szabályozásában. Előzetes in vitro kísérleteink során két új effektust figyeltünk meg: (i) A GAP43 kötődik a glicerolipid mediátor lizofoszfatidsavhoz, míg (ii) a CaM szfingolipid mediátor szfingozin kötőpartnere. Mindkét esetben a fehérjék a lipidek asszociált formáival hatnak kölcsön, amelyek valószínűleg a membrán környezetet utánozzák, hiszen mindkét lipid membránhoz kötött és lokalizált jelátviteli folyamatokban keletkezik. Ahhoz, hogy megérthessük ezeknek a kölcsönhatásoknak a szerepét az idegvégződésekben, először meg kell határoznunk a négykomponensű rendszerben fellépő kötődések paramétereit in vitro. Munkánk során jellemezni fogjuk az új lipid-fehérje kölcsönhatásokat és azok funkcionális következményeit. Különös figyelmet fordítunk a szerkezetileg rendezetlen fehérjékhez tartozó GAP43 konformációs változásaira a kötődések során, részleges szerkezeti rendeződést keresve. Reméljük, hogy ezek a megfigyelések hozzájárulnak az ilyen fehérjék szerkezet-funkció összefüggésének jobb megértéséhez is. Egy másik fontos és alig feltárt terület az in vitro lipid-fehérje kölcsönhatások in vivo relevanciájának megmutatása.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média illetve az adófizetők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI számára.

Az idegsejtek kommunikációjuk során nyúlványokat bocsátanak egymás felé, hogy kapcsolatokat alakítsanak ki. Az idegvégződések növekedésének, irányításának bonyolult szabályozása van, amelynek számos komponensét nem ismerjük, a folyamatot még nem értjük tökéletesen. Jelen kutatás során megvizsgáljuk annak lehetőségét, hogy az idegvégződésekben található két fehérje, az idegsejtek növekedését alapvetően meghatározó GAP43 és a számos fehérje aktivitását szabályozó kalmodulin (CaM) egymással való kölcsönhatását befolyásolják-e olyan membránban keletkező lipidek, amelyek maguk is jelátvivő molekulák. Ez logikus feltételezés, hiszen mások megmutatták, hogy a GAP43-CaM komplex a membránkörnyezetben alakul ki. Előzetes eredményeink szerint két lipid is képes fehérjéinkhez kötődni: a GAP43-hoz a lizofoszfatidsav, míg a CaM-hoz a szfingozin. Érdekes, hogy mindkét esetben a fehérjék a lipidek alkotta felszínhez kötődnek, ami a természetes membránokban is megvalósulhat a jelátviteli folyamatokban. Munkánk során felderítjük ezen két fehérje és két lipid alkotta rendszer kölcsönhatási viszonyait, mennyiségileg jellemezzük kötődésüket és sejtkultúrákat használva megvizsgáljuk, hogy élő sejtekben is létrejönnek-e a kölcsönhatások. Különösen érdekel minket ezen kötődések hatása a fehérjék működésére, mert ettől az idegszálak növekedését, írányítását végző apparátus jobb megértését várjuk. Kísérleteink a lipid-fehérje kölcsönhatások, valamint a szerkezetileg rendezetlen fehérjék működésének jobb megismeréséhez is vezetnek. Eredményeink megteremthetik az alapját, hogy az idegszálak regenerációját új módokon serkentsük, távlatilag új hatásmechanizmussal működő gyógyszereket fejlesszünk.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

The brain-abundant phosphoprotein, the growth associated protein 43 (GAP43) is considered a crucial component in axonal growth, synaptic plasticity and neuroregeneration. However, its functions are poorly understood at the molecular level. The probable mechanism of its action is based on the regulation of local actin dynamics which in turn is under the control of Ca2+ signals in many ways. Calmodulin (CaM), the ubiquitous Ca2+ sensor of eukaryotic cells, is involved in a wide variety of signalling events. GAP43 and CaM form a complex suggested to be bound to the membrane. The molecular state and, therefore, the activity of both GAP43 and CaM can also be regulated by the signalling-induced accumulation of lipid mediators. Recently it was found, that the signalling lipid sphingosine (Sph) can bind to CaM. On the other hand, we have shown that another mediator lipid, the lysophosphatidic acid (LPA) interacts with GAP43. The aim of this project is to characterize the interaction of GAP43 and CaM in the presence of Sph and LPA by means of biochemical and biophysical methods. The effects of the Ca2+ level and the phosphorylation state of GAP43 will also be investigated. The physiological relevance of the lipid binding on the protein-protein complex formation such as direct inhibition of CaM by Sph will also be tested in human cell lines utilizing immunochemical techniques. CaM binding to Sph is also planned to be determined by crystallographic methods. Our results will significantly contribute to the understanding of the complexity in cellular signalling as well as of protein-lipid interactions.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

This research focus on the extensively studied field of signal transduction of primary importance: how the interaction of GAP43 and CaM in nerve endings is controlled by the signalling lipids LPA and Sph. At present it is not clear which protein component is regulated by the other and how microenvironmental factors, like the signalling lipids produced in the membrane, influence the outcome of the interaction. The study of the GAP43-CaM-LPA-Sph two protein – two lipid system is of outstanding significance since it reveals informations controlling the molecular state and therefore the function of all the four components involved in signalling.
The results of the project will contribute to further our understanding in the following topics:
(i) the identification of novel interactions regulating axonal growth,
(ii) the nature of the downstream signalling targets of both Sph and LPA,
(iii) the inhibition of the action of CaM by Sph,
(iv) the links between the calcium and lipid signalling,
(v) the structure and mechanism of protein-lipid interactions,
(vi) the way the intrinsically unstructured protein GAP43 works,
(vii) the role of GAP43 oligomerization in its functional activity.
We also expect to show the in vivo relevance of our in vitro findings utilizing cell lines.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

The interaction of the physiologically important proteins, GAP43 and CaM is documented in vitro and in vivo as well, but there are a debate in the field about its nature and consequences. GAP43 is a crucial component in axon guidance, synaptic plasticity, and neuroregeneration. CaM is the principal effector protein of Ca2+ signalling. They are present simultaneously in nerve endings and it is suggested that their complex is attached to the membrane. Nevertheless, it is not clear whether CaM regulates the activity of GAP43, or GAP43 controls the availability of CaM. It is likely, that factors present in the microenvironment of the complex will modify the localization and function of the constituent proteins. In this project, we will investigate the role of two signalling lipids in controlling this interaction. In our preliminary in vitro work we observed two novel effects: (i) GAP43 can bind to the glycerolipid mediator lysophosphatidic acid, while (ii) CaM is a binding partner for the sphingolipid mediator sphingosine. In both cases, the proteins interact with an associated form of the lipids, possibly mimicking the membrane environment, because both lipids emerges in signalling processes in a membrane-delimited and localized manner. To understand the regulatory roles of these interactions in nerve endings, we have to determine first the binding parameters arise in this four-component system in vitro. During the course of this work, we will characterize the novel lipid-protein interactions and their functional outcomes. Special attention will be paid on the conformational changes of the intrinsically unstructured protein GAP43 upon binding to its partners, looking for a partial ordering in its structure. We hope this result will contribute to a better understanding of the structure-activity relationship of IUPs. Another important yet partially explored perspective is to show the in vivo relevance of the protein-lipid interactions.
The results of the proposed project may contribute in the future to design better medicine for nerve regeneration. Obviously, this would be a great achievement in the point of view of those suffering nerve injuries and for the elderly people as well.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NKFI in order to inform decision-makers, media, and the taxpayers.

Nerve cells develop axons and dendrites to communicate each other. The growth and pathfinding of nerve endings are under complex regulation. This regulation is not completely understood, many components of it are still unknown. Two main protein factors are identified and their complex formation at the membrane has been demonstrated. One of them is GAP43, a crucial component of neuronal growth and the other is calmodulin (CaM), a key regulator of the activity of numerous proteins. In this proposed research we will investigate the possibility that membrane-born lipid mediators might affect their complex formation, localization, and activity. In our preliminary work we found that two lipids, generated themselves in signalling processes, are able to bind to these proteins: GAP43 is a binding partner for lysophosphatidic acid, while CaM binds to sphingosine. Interestingly, in both cases the proteins bind to lipid surfaces, perhaps mimicking the binding processes in natural membranes. In the course of the project we will explore possible interactions in the two-protein-two-lipid system, quantitatively characterize their binding parameters, and study whether these interactions exist in live cells utilizing cell lines. We are especially interested in the functional consequences of these binding events as such informations can lead to better understanding of the processes regulating nerve growth and pathfinding. Our experiments will explore new protein-lipid interactions and functioning of the intrinsically unstructured proteins. Our results may pave the road to stimulate nerve regeneration in novel ways, possibly develop medicin with new mechanism of action in the future.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
Az idegvégződések növekedése és útkeresése komplex szabályozás alatt áll, melyben két fehérje faktornak is jelentős szerepet tulajdonítanak. A rendezetlen fehérje GAP43 az idegnyúlványok növekedésében alapvető szereppel bír, míg a kalmodulin (CaM) a Ca2+-függő jelátvitel kulcseleme. Komplexálódásukat a plazmamembrán környezetében kimutatták. Jelen kutatás során jellemeztük a két fehérje közötti kölcsönhatás erősségét, ill. annak változását a Ca2+-koncentráció, valamint a szfingozin (Sph) és a lizofoszfatidsav (LPA) lipid mediátorok jelenlétének függvényében. Megmutattuk, hogy a Sph kötődik a CaM-hoz és gátolja annak működését, míg az LPA a GAP43 oligomerizációját és szerkezetének részleges rendeződését okozza. Azt találtuk, hogy a lipid mediátorok a természetes membránokban előforduló nanodoménekhez hasonló, asszociált formában képesek megakadályozni a GAP43-CaM komplex kialakulását úgy, hogy nemcsak a kölcsönhatás affinitására hanem a kinetikájára is befolyással bírnak. Sejtvonalakon végzett kísérleteink alapján a GAP43 foszforilációjával megváltozhat a fehérje lokalizációja és CaM-hoz való kötődése, továbbá a Sph idegnyúlvány-visszahúzó hatása a CaM-t gátló hatásának tulajdonítható. Eredményeink szerint a GAP43 és a CaM fehérjék működése szabályozható a jelátviteli folyamatok során a membránban keletkező Sph és LPA lipid mediátorokkal.
kutatási eredmények (angolul)
The growth and pathfinding of nerve endings are under complex regulation. Two main protein factors are identified and their complex formation at the membrane has been demonstrated. One of them is the intrinsically unstructured protein GAP43, a crucial component of neuronal growth and the other is calmodulin (CaM), a key regulator of the Ca2+-dependent signal transduction. In this project we characterized the interaction strength of these proteins, as well as its dependence on Ca2+-ions and the lipid mediators sphingosine (Sph) and lysophosphatidic acid (LPA). We demonstrated that Sph binds CaM and inhibits its actions, while LPA interacts with GAP43 inducing its partial folding and modulating its oligomeric state. We showed that both lipids, if in an associated form mimicking specific membrane surfaces, regulate the complex formation of CaM and GAP43, affecing their complexation. We found that besides affinity the binding kinetics of GAP43 to CaM also depends on its oligomeric state and the presence of the lipid mediators. Utilizing a neuronal cell line, we depicted that phosphorylation of GAP43 affects its membrane localization and CaM binding, and we attributed the neurite withdrawal effect of Sph to its inhibition on CaM. Taken together, the function of GAP43 and CaM can be regulated by the presence of the Sph- and LPA-rich membrane surfaces.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=104344
döntés eredménye
igen




vissza »