A flagelláris exportszignál és a FliI ATPáz kölcsönhatásának vizsgálata  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
104726
típus K
Vezető kutató Vonderviszt Ferenc
magyar cím A flagelláris exportszignál és a FliI ATPáz kölcsönhatásának vizsgálata
Angol cím Recognition of the flagellar export signal by the FliI ATPase
magyar kulcsszavak bakteriális flagellum, flagelláris export, exportszignál, FliI, flagellin
angol kulcsszavak bacterial flagellum, flagellar export, export signal, FliI, flagellin
megadott besorolás
Általános biokémia és anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok)100 %
Ortelius tudományág: Molekuláris biológia
zsűri Molekuláris és Szerkezeti Biológia, Biokémia
Kutatóhely Bio-nanotechnológiai és Műszaki Kémiai Kutatóintézet (Pannon Egyetem)
résztvevők Jankovics Hajnalka
Klein Ágnes
Meiczinger Mónika
Muskotál Adél
Sajó Ráchel
Tőke Orsolya
Tóth Balázs
projekt kezdete 2013-01-01
projekt vége 2016-05-31
aktuális összeg (MFt) 30.027
FTE (kutatóév egyenérték) 5.82
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

A flagellumok a baktériumok mozgásszervei. A flagellumok citoplazma membránon kívüli részét alkotó fehérjekomponenseket a flagellum-specifikus exportapparátus juttatja el a filamentumok belső csatornáján keresztül beépülési helyükre, a filamentumok végére. A flagellum alapi részének citoplazmikus oldalán található flagelláris exportapparátus egyik meghatározó komponense az ATPáz aktivitással rendelkező vízoldékony FliI fehérje, ami valószínűleg hexamer formában végzi el az exportszubsztrátok kitekerését. Még ma sem világos, hogy miként ismeri fel az exportapparátus a kijuttatandó flagelláris fehérjéket, hiszen azok sem lehasítható szignálpeptidet, sem közös szekvencia-motívumot nem tartalmaznak.
Munkánk célja a flagelláris exportrendszer szubsztrátfelismerési mechanizmusának jobb megértése. Nemrégiben megmutattuk, hogy a helikális filamentumokat felépítő flagellin fehérje 26-47 szegmense tartalmazza a felismerési jelet az exportapparátus számára. Ez a szegmens a flagellin rendezetlen N-terminális régiójában található. Legújabb kutatásaink arra utalnak, hogy az exportszignál képes kötődni az exportrendszer FliI ATPáz komponenséhez. Génsebészeti, biokémiai és biofizikai megközelítések kombinált alkalmazásával azt szeretnénk felderíteni, hogy milyen molekuláris események mennek végbe a rendezetlen exportszignál FliI molekulához való kötődése során.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

A tervezett kutatások alapkérdése az, hogy a FliI ATPáz miként képes az extracelluláris flagelláris komponensek különböző exportszignáljainak felismerésére. A terminális régiók rendezetlensége a flagellumok filamentáris részét felépítő axiális fehérjék általános szerkezeti sajátossága. A rendelkezésre álló kísérleti eredmények alapján azt gondoljuk, hogy a szerkezeti rendezetlenség az exportálandó flagelláris fehérjék N-terminális régiójában található exportszignáljának meghatározó konformációs tulajdonsága.
Szeretnénk megérteni, hogy milyen molekuláris események történnek a flagelláris exportszubsztrátok FliI általi felismerése során. Miként képes egy rendezetlen szegmens exportszignálként funkcionálni? Melyek a szingálszekvencia meghatározó tulajdonságai? Feltevésünk szerint a szignál a FliI molekulához kötődve egy jól meghatározott konformációba rendeződik. A felismerőhely valószínűleg egy keskeny vájatban vagy csatornában található, amihez csak egy nyújtott polipeptidlánc férhet hozzá. Irányított mutagenezis alkalmazásával tervezzük feltérképezni a szignálszekvencia alapvető konformációs tulajdonságait. Izotermális titrációs kalorimetria és kettős polarizációs interferometria segítségével kívánjuk jellemezni a FliI-exportszignál kölcsönhatás erősségét és termodinamikai paramétereit, NMR vizsgálatok révén pedig meghatározni a kölcsönhatás szerkezeti hátterét. Arra is választ keresünk, hogy a FliI oligomerizációs állapota mennyiben befolyásolja az exportszignállal való kölcsönhatást.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

A bakteriális flagellumok a sejtek mozgatását végző nanogépezetek. Az élő sejtekben található szupramolekuláris rendszerek rendelkeznek az önszerveződés képességével, s komplex funkciókat képesek ellátni precízen szabályozott módon. Ezen rendszerek tulajdonságainak felderítése hatékony segítséget jelenthet a modern technológiák fejlesztésében. Kutatásaink konkrét célja a bakteriális flagellumok szerkezeti és önszerveződési tulajdonságainak jobb megértése, s a megszerzett tudás bio-nanotechnológiai alkalmazása.
A flagelláris exportapparátus egy több ezer alegységből álló komplex rendszer felépülését szolgája a fehérje építőelemek szabályozott kijuttatása révén. A flagelláris exportrendszer és a patogén baktériumok virulens fehérjéinek kijuttatását végző hármas típusú exportrendszer között szoros rokonság figyelhető meg. A tervezett munka tágabb értelemben elősegíti a hármas típusú exportfolyamatok alaposabb megismerését is, s nem utolsó sorban betekintést nyújt egy komplex nanogépezet felépülésének mechanizmusába. A virulens fehérjék kijuttatási folyamatainak alaposabb megismerése révén nagyobb eséllyel vehetjük fel a küzdelmet a bakteriális fertőzések elleni küzdelemben, s hatékonyabb védekezési eljárások kidolgozására nyílik lehetőség. A várható eredmények biotechnológiai alkalmazásokat is ígérnek, lehetővé téve a flagelláris exportrendszer révén kijuttatni a sejtből a baktériumokban nagy mennyiségben termeltetett rekombináns fehérjéket. Egy ilyen szekretáló expressziós rendszer számos előnyt kínál, hiszen így szükségtelenné válik a sejtek feltárása, s lehetővé válik a termeltetett fehérjék funkcionálisan aktív formában való egyszerű előállítása. Végezetül, a tervezett kutatások segítenek a rendezetlen fehérjék működési módjainak megismerésében is.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média illetve az adófizetők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI számára.

Kutatásaink célja a bakteriális flagellumok szerkezetének és működésének feltárása. A flagellumok a baktériumok mozgásszervei. Sejtmembránba ágyazott részük magában foglal egy parányi, 50 nm átmérőjű, protonok által hajtott motort, ami a hozzá kapcsolódó 5-20 micron hosszúságú helikális filamentumot (ostorszálat) propellerként forgatja. A filamentumot alkotó fehérjealegységek a szerkezet belsejében található szűk csatornán keresztül jutnak el beépülési helyükre, a filamentumok végére. A flagellumok tövénél található a flagelláris exportrendszer végzi a filamentumot alkotó fehérjekomponensek felismerését és kijuttatását. A projekt célja annak kiderítése, hogy miként azonosítja az exportrendszer a kijuttatandó fehérjéket, hogyan tudja megkülönböztetni őket a sejtben található több ezer egyéb fehérjétől.
A kutatás eredményei biotechnológiai alkalmazási lehetőségeket is ígérnek. A flagelláris export mechanizmusának megismerése lehetőséget teremt a baktériumokkal termeltetett idegen fehérjék sejtből való egyszerű kijuttatására és olcsó előállítására. A tervezett kutatások révén közelebb juthatunk a baktériumok fertőzési mechanizmusainak alaposabb megértéséhez, s ezáltal hatékonyabb védekezési stratégiák kidolgozásához is, mert számos betegséget okozó baktérium virulens fehérjéinek kijuttatását is egy hasonló exportrendszer végzi.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

Flagella are the locomotion organelles of bacteria. External flagellar proteins are synthesized in the cell and exported sequentially by the flagellum-specific export apparatus to the site of assembly at the distal end of the growing filament. They are assumed to move through the narrow central channel of the flagellum as partially unfolded monomers. The flagellar export system is located at the cytoplasmic face of the basal part of the flagellum. The FliI ATPase is a key cytoplasmic component of the export machinery which self-assembles into a hexameric complex upon binding to the export core complex, and helps initial entry of the substrate N-terminal chain into a narrow pore of the export gate. It is unclear how the secreted proteins are recognized by the export system since they have no cleavable signal sequences or any common signals at the primary sequence level.
This work addresses better understanding of the mechanism of substrate recognition by the flagellar export machinery. Our studies have revealed that the 26-47 segment of flagellin, the main component of helical filaments, contains the recognition signal for the flagellar export system. This segment lies within the disordered N-terminal region of the molecule. Recent experiments indicate that the FliI ATPase component of the export apparatus binds and recognizes the export signal. Our efforts will be focused on the characterization of the FliI-export signal interaction. Combining genetic engineering, biochemical and biophysical approaches, we are going to reveal molecular events underlying the recognition process.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

This work addresses the recognition mechanism of flagellar export substrates by the FliI ATPase. The most elusive part of flagellar export is the recognition of export substrates. We have recently demonstrated that a 22-residue long segment within the N-terminal disordered region of Salmonella flagellin serves as the recognition signal for the flagellar export system. Terminal disorder is a common structural feature of the axial proteins of bacterial flagellum. We believe that structural disorder is an essential feature of the recognition signal for the flagellum-specific export system.
Our research aims at understanding the molecular events behind substrate recognition by the FliI ATPase. How can a disordered segment function as a recognition signal? What are the essential features of the signal sequence? We hypothesize that the export signal sequence is induced to adopt a specific structure only in association with the recognition subunit(s) of the flagellar export machinery. The recognition site presumably lies in a narrow cleft or channel which can accommodate only extended polypeptide chains. We plan to reveal the essential features of the signal by rationally designed mutagenesis studies and characterize the interaction by calorimetry and dual polarization interferometry. To understand the mechanism of conformational ordering during the recognition process, we are going to determine the structure of the FliI-export signal complex by NMR spectroscopy. The role of the oligomeric state of FliI in the interaction with the export substrate will be also explored.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

The bacterial flagellum is a protein-based nanomachine for locomotion. Molecular machines of living cells have the capability for self-assembly and can fulfill complex functions in a highly controlled fashion. Modern technology can borrow solutions from living cells for a number of practical problems. Our research interest is focused on the understanding of structural organization and self-assembly of bacterial flagellum, and exploitation of the acquired knowledge for applications in bio-nanotechnology.
The flagellar export system serves supramolecular assembly by controlled secretion of protein building blocks. Flagellar export and type III secretion of virulence factors by many species of pathogenic bacteria show close similarities. The broader impacts of the proposed work are a better basic understanding of membrane transport processes in general, greater knowledge of type III secretion and insight into the assembly of an elegant molecular machine. Better understanding of type III targeting and secretion pathways is important in resolving the basis of virulence and opening new approaches and more effective treatments to combat the threat of bacterial infection. The results may foster applications in biotechnology by utilizing the flagellum-specific export system to secrete large amounts of overexpressed recombinant proteins into the culture media. Constructing such a secreting overexpression system offers several advantages, like avoiding cell disruption, easy purification and non-aggregated correctly folded proteins. Finally, this work will also contribute to a better understanding of the functions of structurally disordered proteins.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NKFI in order to inform decision-makers, media, and the taxpayers.

Our research aims at understanding the structure and function of bacterial flagella which are the locomotion organelles of bacteria. Their membrane embedded part contains a molecular nanomachine which rotates long helical filaments driving the bacterium through the liquid environment. External flagellar proteins are synthesized within the cell and exported sequentially through the narrow central channel of the flagellum by the flagellar export apparatus to the site of assembly at the distal end of the growing filament. The flagellar protein export system is located at the cytoplasmic face of the basal part of the flagellum to distinguish flagellar proteins from other cytoplasmic proteins and to facilitate their transportation. The aim of this work is to reveal how the secreted proteins are recognized by the flagellar export system.
The flagellar export shows close similarity to the secretion of virulence factors by many species of pathogenic bacteria. Better understanding of functioning of these secretion pathways is important in resolving the basis of virulence and opening new approaches and more effective treatments to combat the threat of bacterial infection. The results may foster applications in biotechnology by utilizing the flagellum-specific export system to secrete large amounts of overexpressed recombinant proteins into the culture media.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
A baktériumok flagelláris filamentumait alkotó fehérjealegységek sejtből való kijuttatását a flagellumok tövénél található speciális exportrendszer végzi. Munkánk célja a flagelláris exportrendszer szubsztrátfelismerési mechanizmusának jobb megértése. Megmutattuk, hogy a korábbi vélekedéssel ellentétben az exportapparátus FliI ATPáz kompnense nem vesz részt a flagellumok helikális filamentumait alkotó flagellin alegységek felismerésében és az exportcsatornához történő szállításában. Korábbi vizsgálataink szerint a flagellin rendezetlen szerkezetű 26-47 szegmense tartalmazza a felismerési jelet az exportapparátus számára. NMR spektroszkópiás vizsgálataink bebizonyították, hogy az exportszignál megfelelő körülmények között képes amfipatikus helikális konformációba rendeződni. Rámutattunk arra, hogy hasonló rendeződési folyamat megy végbe az eukarióta sejtorganellumokba történő fehérjeexportot irányító szignálszekvenciában az exportrendszerrel való kölcsönhatás során. Jellemeztük a flagellin exportját segítő FliS chaperone fehérje konformációs tulajdonságait. Megállapítottuk, hogy a FliS nagyfokú konformációs plaszticitással rendelkezik, ami elősegíti, hogy működése során az exportapparátus többféle komponensével is kölcsönhatásba léphessen. Megmutattuk azt is, hogy előállíthatók különféle előnyös katalitikus és molekulafelismerési tulajdonságokkal rendelkező flagellin variánsok, amelyek a flagelláris exportrendszer révén a gazdasejtből egyszerűen kijuttathatók és izolálhatók.
kutatási eredmények (angolul)
Axial proteins of bacterial flagella are exported by the flagellum-specific export apparatus through the narrow central channel of the flagellum to the site of assembly at the distal end of filament. Our work aims at better understanding of the mechanism of substrate recognition by the export system. We demonstrated that in spite of the general view the FliI ATPase component of the export apparatus is not involved in the recognition and delivery of flagellin to the export gate. Export of flagellar proteins requires a signal located within their N-terminal disordered part. Our NMR experiments revealed that the signal sequence of flagellin may acquire an amphipathical helical structure under appropriate conditions. Our observations raise the possibility that the signal sequence may undergo amphipathic helical ordering upon interaction with the recognition unit of the flagellar export machinery in a similar way as found for translocation signals directing protein export into intracellular eukaryotic organelles. FliS is a specific chaperone facilitating the export of flagellin. Our studies demonstrated that FliS shows substantial structural plasticity allowing multiple interactions with various components of the export system. We developed flagellin-based fusion proteins possessing various catalytic and molecular recognition functionalities which were secreted from the host cell by the flagellar export system in large amounts allowing easy and cost-effective purification.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=104726
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
Vonderviszt F, Sajó R, Muskotál A, Kovács M, Dobó J, Závodszky P: A flagelláris exportrendszer FliI ATPáz komponensének szerepe az exportszignál felismerésében., Program- és absztraktfüzet, 2013
Wéber Aletta: Génkonstrukció előállítása a flagelláris exportrendszer hatékonyságának vizsgálatára, Pannon Egyetem, szakdolgozat, 2013
Vonderviszt F, Sajó R, Muskotál A, Kovács M, Dobó J, Závodszky P: A flagelláris exportrendszer FliI ATPáz komponensének szerepe az exportszignál felismerésében., 43. Membrántranszport Konferencia. Sümeg, 2013. május 21-24; Absztraktfüzet p.23, 2013
Sajó R, Liliom K, Muskotál A, Klein Á, Závodszky P, Vonderviszt F, Dobó J: Soluble components of the flagellar export apparatus, FliI, FliJ, and FliH, do not deliver flagellin, the major filament protein, from the cytosol to the export gate, BBA Molecular Cell Research 1843:2414-2423, 2014
Baráth V: A flagelláris exportszignál meghatározó szegmenseinek azonosítása, Pannon Egyetem, TDK dolgozat, 2014
Sajó R, Liliom K, Tóth B, Muskotál A, Klein Á, Závodszky P, Dobó J, Vonderviszt F: Recognition of flagellin by the flagellar export apparatus, EMBO Conference "Mechanisms and regulation of protein translocation", 21-25 March 2015; Dubrovnik, Croatia, 2015
Sajó R, Liliom K, Muskotál A, Klein Á, Závodszky P, Vonderviszt F, Dobó J: Soluble components of the flagellar export apparatus, FliI, FliJ, and FliH, do not deliver flagellin, the major filament protein, from the cytosol to the export gate, BBA Molecular Cell Research 1843:2414-2423, 2014
Baráth V: A flagelláris exportszignál meghatározó szegmenseinek azonosítása, Pannon Egyetem, ITDK dolgozat, 1. helyezett, 2014
Sajó R, Tőke O, Hajdú I, Jankovics H, Micsonai A, Dobó J, Kardos J, Vonderviszt F: Structural plasticity of the Salmonella FliS flagellar export chaperone., FEBS Letters 590:1103-1113, 2016
Klein Á, Szabó V, Kovács M, Patkó D, Tóth B, Vonderviszt F.: Xylan-Degrading Catalytic Flagellar Nanorods., Molecular Biotechnology 57:814-819, 2015
Tőke O, Vonderviszt F: Amphipathic helical ordering of the flagellar secretion signal of Salmonella flagellin, Biochemical and Biophysical Research Communications DOI:10.1016/j.bbrc.2016.06.012, 2016
Kovács Mátyás: A baktériális flagelláris filamentumok kiépülésének szabályozásában meghatározó szerepet játszó FliK fehérje klónozása, előállítása és kölcsönhatásainak vizsgálata, Pannon Egyetem, Diplomadolgozat, 2015
Kovács Noémi: Mesterséges flagelláris export szubsztrát létrehozása és működésének detektálása, Pannon Egyetem, ITDK dolgozat, 1. helyezett, 2015
Kovacs B, Patko D, Székacs I, Orgovan N, Kurunczi S, Sulyok A, Khann NQ, Toth B, Vonderviszt F, Horvath R: Flagellin based biomimetic coatings: from cell-repellent surfaces to highly adhesive coatings, Acta Biomaterialia, közlésre elfogadva, 2016





 

Projekt eseményei

 
2014-02-11 15:31:35
Résztvevők változása
2013-05-29 16:44:59
Résztvevők változása




vissza »