Baktériumok metabolikus hatékonyságának és genetikai stabilitásának növelése hibrid genomok létrehozásával  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
106231
típus PD
Vezető kutató Umenhoffer Kinga
magyar cím Baktériumok metabolikus hatékonyságának és genetikai stabilitásának növelése hibrid genomok létrehozásával
Angol cím Improving bacterial metabolic efficiency and genomic stability by directed genome shuffling.
magyar kulcsszavak szintetikus biológia, genome-shuffling, E. coli, genetikai hibrid, metabolizmus
angol kulcsszavak synthetic biology, genome shuffling, E. coli, genetic hybrids, metabolism
megadott besorolás
Általános biokémia és anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok)50 %
Ortelius tudományág: Moleculáris tervezés, de novo tervezés
Genomika, összehasonlító genomika, funkcionális genomika (Orvosi és Biológiai Tudományok)25 %
Mikrobiológia: virológia, bakteriológia, parazitológia, mikológia (Orvosi és Biológiai Tudományok)25 %
zsűri Molekuláris és Szerkezeti Biológia, Biokémia
Kutatóhely Biokémiai intézet (MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont)
projekt kezdete 2012-09-01
projekt vége 2015-08-31
aktuális összeg (MFt) 15.360
FTE (kutatóév egyenérték) 2.40
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

A szintetikus biológia eszköztára révén ma már akár félszintetikus bakteriális genomok tervezése és összeállítása is megkísérelhető. Csoportunk úttörő szerepet játszott az E. coli K-12 baktérium kísérletes genomredukciójában. A laterális géntranszfer folyamatokkal (LT) szerzett genomi szigetek (profágok, mobilis elemek) eltávolításával létrehozott, “tiszta” genomú sejt (>20% genomredukció) fokozott genetikai stabilitást és stressztoleranciát mutat, így hasznos gazdasejtként szolgálhat az iparban és kutatásban. Az ipari/biotechnológiai alkalmazásokban azonban – nagyfokú metabolikus hatékonysága miatt – egy másik E. coli törzs, a BL21 a favorizált gazdasejt. A BL21 hátránya, hogy kevésbé kutatott és genetikailag nehezebben alakítható. Célunk az alapvetően hasonló, de a LT szigetekben jelentősen különböző K-12 és BL21 kedvező tulajdonságainak egyesítése a genomok irányított kombinálásával. A BL21 genom mobil genetikai elemeket tartalmazó részeit (~25 szakaszt; a genom ~20 %-át) “tiszta” K-12 genomszakaszokkal tervezzük lecserélni előzetesen már tesztelt módszerekkel és eszközökkel (P1 transzdukció; megfelelő K-12 genomszakaszok markerrel jelölt sorozata), mindeközben monitorozva és megőrizve a BL21 metabolikus képességeit. Ez az átalakítási folyamat nem csak egy értékes gazdasejtet eredményezhet (javított stabilitás és tűrőképesség, hatékonyabb rekombináns fehérje termelés), de hozzájárul annak felderítéséhez is, hogy milyen génváltozatok/hálózatok befolyásolják az anyagcsere hatékonyságát és a genomstabilitást. A munkához minden eszköz a rendelkezésünkre áll, és a projekt kiegészíti a csoport OTKA kutatását (a genomarchitektúra fenotípusra gyakorolt hatásának vizsgálata).

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

Az E. coli baktérium az egyik legalaposabban ismert élőlény, a biotechnológiai ipar gyakran használt gazdasejtje. Mégis, a genom jelentős hányadának funkciója ismeretlen, s nehézségeket okoz, hogy egyes törzsek (pl. BL21) génmérnöki szempontból nehezen manipulálhatók. A K-12 és BL21 törzsek vázgenomja - bizonyos variációkkal - igen hasonló, ugyanakkor a genomi (LT) szigetek jelentősen eltérnek. A törzsek közötti genom „shuffling” fényt deríthet mind alapkutatási, mind gyakorlati jelentőségű kérdésekre. 1. Miért konzerválódnak az evolúció folyamán a profágok/mobilis genetikai elemek? Úgy tűnik, egyes anyagcsereutak kódolásával és a genetikai változatosság biztosításával a sejtek alkalmazkodását segítik, ugyanakkor instabilitást okozhatnak (káros mutációk, sejtlízis), és feleslegesen terhelhetik a metabolizmust. Van-e valamilyen fitnesz költsége az eltávolításuknak? 2. A mobilis elemek eltávolítása előnyös a genom stabilitása és egyes alkalmazások szempontjából. De mi a határa a genom mesterséges csökkentésének/ átrendezésének? Van-e következménye, ha nagyléptékű módosításokkal megváltoztatjuk a genom szerkezeti elemeinek eloszlását? 3. A BL21 törzs elsősorban gyors növekedése és kiváló rekombináns fehérjetermelése miatt vált kedveltté. Mi lehet ezek metabolikus alapja? A bioinformatikai elemzésekkel feltárt genetikai eltérések nem adnak kielégítő magyarázatot erre a kérdésre. A fokozatos, genomléptékű változtatások - a fehérjetermelés hatékonyságának folyamatos mérésével kísérve - azonosíthatja azokat a fontos génvariációkat, amelyek a magas metabolikus hatékonyságért felelősek.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

A tervezett munka kiterjeszti a szintetikus biológia eszköztárát az “a la carte” szemi-szintetikus genomok tervezése és kivitelezése terén, és közelebb visz ahhoz, hogy egy bakteriális sejt működését teljes egészében megértsük. Az E. coli az alapkutatások fontos modellorganizmusa, és alapvető gazdasejt ipari-klinikai jelentőségű molekulák (DNS, metabolitok, fehérjék) termeltetése szempontjából. Mindezek ellenére génjeinek mintegy harmadának működése és biológiai szerepe ismeretlen, és számos, a génállomány összetételére és a genom szerkezetére vonatkozó kérdés megválaszolatlan. A munka során kiterjedt genomi átrendeződések megvalósításával hibrid E. coli törzseket tervezünk létrehozni. Ezek genotípusának részletes elemzése és a fenotípus folyamatos ellenőrzése hozzájárulhat a mobilis genetikai elemek evolúcióban betöltött szerepének megértéséhez, a genomszerkezeti átrendeződések határainak felderítéséhez és a hatékony metabolikus aktivitásért felelős anyagcsereutak azonosításához. Az így megszerzett ismeretek hozzájárulnak a rendszerbiológiai metabolikus modellezés és tervezés fejlődéséhez. Az alapkutatási jelentőség mellett a kutatás ipari/biotechnológiai projektekben alkalmazott, „feljavított sejtgyárakat” eredményezhet

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média illetve az adófizetők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI számára.

Összefoglalásul: laboratóriumunk egyedi eszközeinek és a felhalmozott genommérnöki tapasztalatoknak a felhasználásával az E. coli baktérium két változatának genetikai hibridjeit tervezzük létrehozni. Az E. coli baktériumnak számos, egyedi tulajdonságokkal rendelkező variánsa létezik. Egyes változatai (pl. a laboratóriumunkban létrehozott, nagymértékben egyszerűsített, genetikailag stabilizált K-12 sejt, vagy az iparban gyakran használt BL21 törzs) az alapkutatások fontos modellorganizmusai és különböző biotechnológiai alkalmazások gazdasejtjei. Irányított genommérnöki módszerekkel két, viszonylag távoli evolúciós viszonyban lévő törzs (K-12 és BL21) genetikai hibridjét tervezzük létrehozni. A munka célja a két kiindulási törzs előnyös tulajdonságainak (genetikai stabilitás, magas tolerancia egyik oldalról, hasznos molekulák hatékony termeltetése a másik oldalról) egyesítése egyetlen sejtben. A tervezett kutatás (i) a félszintetikus, “a la carte“ genomok létrehozásának újfajta lehetőségeit deríti fel, (ii) kiegészíti tudásunkat a genetikai stabilitás biológiai alapjairól, a környezeti hatásokkal szembeni tűrőképességről, az anyagcsere hatékonyságának tényezőiről, valamint (iii) létrehozhat hatékony teljesítményű gazdasejteket ipari/biotechnológiai alkalmazásokhoz.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

Synthetic biology entered a phase where large-scale engineering/assembly of (semi)synthetic bacterial genomes for various purposes became feasible. Our group has pioneered experimental genome reduction of E. coli by systematically deleting laterally transferred (LT) islands (prophages, mobile elements) from the genome of E. coli K-12. The “clean” genome cell (>20% genome reduction) displayed improved genetic stability and tolerance, and became a valuable host cell for research and industry. However, due to its superior metabolic performance, the primary host for industrial use is less-studied and hard-to-manipulate E. coli BL21. We aim at combining the favorable features of K-12 and BL21 by semi-targeted genome shuffling. Marked segments of “clean” genome K-12, all available in our collection, will be sequentially transferred to BL21 by P1 transduction to replace regions contaminated by mobile element-harboring LT islands (~25 targeted segments), thereby “cleaning” the genome of the recipient. Each step will be monitored/analysed for metabolic performance to preserve favorable features of BL21. In about 25 cycles, a cell with a hybrid genome (~20% K-12, ~80% BL21), merging the desired characteristics (improved stability and tolerance, superior recombinant protein production) can be selected. The transfer/monitoring process not only produces a valuable industrial host cell, but also allows identification of the basis for enhanced metabolic performance and genetic stability. The necessary tools are all available in our laboratory, and the project complements the general umbrella grant of the group aimed at deciphering the effects of genome architecture on the phenotype.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

E. coli is perhaps the best known organism, and is used in countless applications. However, not all of its variants are easily manipulated genetically, and the functional roles of many, structurally distinct genomic elements are, at least partially, unknown. K-12 and BL21 have a similar core genome (with notable variations), but possess significantly diverged LT islands. The proposed genome shuffling between the strains might shed light on questions of both general and practical significance. 1. Why are prophages and other mobile genetic elements preserved in the course of evolution? They seem to serve adaptation by providing extra metabolic functions and routes to genetic variation, but can also cause deleterious genetic instability, excess metabolic load and cell lysis. What is the fitness cost/benefit ratio resulting from their removal? 2. Cleaning the genome from mobile elements is beneficial for stability, a desired feature in many applications. But what are the limits of artificially shortening/re-arranging a genome shaped by a long evolutionary process? Is there a cost for introducing large architectural modifications and changing the distribution of structurally important sites? 3. BL21 was empirically selected for superior recombinant protein production. What is the metabolic basis for this feature? Genetic differences, revealed by bioinformatic analysis, do not provide a satisfying explanation. Empirical, gradual genome replacement, coupled with constant protein production monitoring, might identify the important genetic variations actually responsible for the enhanced productivity.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

The proposed work expands the repertoire of synthetic biology in the area of designing and constructing semi-synthetic genomes “a la carte”. Moreover, the research would represent a new step towards the goal of full description and understanding a bacterial cell. E. coli is a model organism of basic research, the workhorse of molecular biology, and the platform of choice for the production of DNA, metabolites and many proteins of therapeutic or commercial interest. In spite of being one of the best understood model organisms, roughly one third of its genes have no experimentally verified functions assigned to them, and many questions of gene composition and genome architecture remain unanswered. Here we propose to construct hybrid E. coli strains by extensive genome re-engineering. Detailed genotypic analysis and phenotypic monitoring of the hybrid strains will contribute to our knowledge regarding the evolutionary role of mobile genetic elements, will explore the limits of re-arranging the genome architecture, and might identify the gene and pathway variants responsible for enhanced metabolic performance. The knowledge obtained will contribute to improvements in metabolic modeling and engineering. Moreover, beyond the scientific significance, the project would produce improved cells that can be used as superior hosts for industrial applications.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NKFI in order to inform decision-makers, media, and the taxpayers.

In summary, using our unique tools and expertise in genetic engineering of bacteria, we plan to construct genetic hybrids of two strains of the bacterium E. coli. This bacterium is one of the most important model organisms for basic research and host cell for biotechnological applications. There are many variants of the bacterium, each displaying different characteristics. We plan to construct genetic hybrids of two strains by a rational, targeted approach, with the aim of combining the beneficial features of both parents in a single cell. The proposed research would (i) explore novel ways of constructing “a la carte“, semi-synthetic genomes for various (e.g., medical or industrial) purposes, (ii) would advance our knowledge regarding the genetic basis of genetic stability, tolerance and enhanced metabolic efficiency, and (iii) could produce host cells with superior performance for biotechnological applications.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
Az Escherichia coli baktériumnak számos, egymástól eltérő tulajdonságokkal rendelkező törzsváltozata létezik. A legalaposabban tanulmányozott variánsok az E. coli K-12 és BL21. A K-12 törzsei az alapkutatások fontos modellorganizmusai, ezzel szemben a BL21 törzsek főleg a ipari/biotechnológiai alkalmazások gazdatörzsei. A K-12 és BL21 törzsek vázgenomja igen hasonló, ugyanakkor a genomi (LT) szigetek jelentősen eltérnek, főként a profágoknak és mobilis genetikai elemeknek köszönhetően. Csoportunk úttörő szerepet játszott az E. coli K-12 baktérium kísérletes genomredukciójában, a laterális géntranszfer által szerzett genomi szigetek eltávolításával létrehozott sejt fokozott genetikai stabilitást és stressztoleranciát mutat. A munka célja a két kiindulási törzs előnyös tulajdonságainak egyesítése volt egy BL21-alapú, hibrid genomú törzsben. Elsőként a Bl21 genomon található profágokat távolítottuk el a két törzs közötti irányított, részleges genomátcseréléssel, felhasználva a tiszta genomú K12-es törzset. A BL21 genomjában megmaradt mobilis elemek inaktiválására egy új, hatékony módszert fejlesztettünk ki, ami kombinálja a CRISPR/Cas9 alapú és a MAGE génmérnöki technikákat. A módszer nem követeli meg az inszerciós elemek genomi pozíciójának és irányultságának ismeretét. A létrejött BL21 alapú hibrid törzs 7 % K-12 szekvenciát hordoz, megőrizte az alaptörzs gyors növekedését és kiváló rekombináns fehérjetermelését és fokozott genetikai stabilitást és stressztoleranciát mutat.
kutatási eredmények (angolul)
Escherichia coli is the most thoroughly analysed organism and its different strains are used in countless applications. The E. coli, BL21(DE3) is a widely used host strain for recombinant protein production. In contrast, other E. coli K-12 strains are easy to manipulate genetically. Despite the fact, that K-12 and BL21 strains have similar core genomes, they possess significantly diverged, laterally transferred genomic islands, mainly consisting of prophages and other mobile genetic elements. We’ve already reduced the E. coli K-12 genome towards a flexible, programmable biological chassis. Moreover, elimination of mobile genetic elements were shown to yield further improvements in the applicability of the K-12 host cell. We set out to combine the favourable traits of BL21 and K-12 in one single genetic hybrid cell-line. Removal of prophages has been achieved by directed genome shuffling between a clean-genome set of K-12 and the BL21(DE3). To inactivate all remaining mobile elements, we developed a novel and efficient technique taking advantage of the robustness of CRISPR/Cas9 aided and MAGE genome editing methods. This combination enabled rapid, mass-inactivation of mobile IS elements, without a priori knowledge of their exact genomic location and directional information. The resulting, BL21-based hybrid strain (BL21D9 ISKO) harbours 7% K-12 sequence, displayed good growth characteristics, retains the excellent protein producing features and increased genome stability.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=106231
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
Kinga Umenhoffer, Balázs Bogos, György Pósfai: Construction of a prophage-free, hybrid-genome E. coli BL21 host strain by directed genome shuffling, The FEBS EMBO 2014 Conference, 2014
Kinga Umenhoffer, Ákos Nyerges, Gábor Draskovits, István Nagy, Bálint Csörgő, Csaba Pál, György Pósfai: Rapid refactoring of bacterial genomes for increased stability and chassis performance, Synthetic Biology Gordon Research Conference 2015 (Boston), 2015
Kinga Umenhoffer, Gabor Draskovits, Akos Nyerges, Balint Csorgo, Istvan Nagy, Balazs Bogos, Edit Timar, Csaba Pal, Gyorgy Posfai: Rapid construction of a prophage- and IS-free, hybrid-genome E. coli BL21, EMBO Meeting 2015 (Birmingham), 2015
Kinga Umenhoffer, Gabor Draskovits, Akos Nyerges, Balint Csorgo, Istvan Nagy, Balazs Bogos, Edit Timar, Csaba Pal, Gyorgy Posfai: Rapid construction of a prophage- and IS-free, hybrid-genome E. coli BL21, EMBO | EMBL Symposium: The Mobile Genome: Genetic and Physiological Impacts of Transposable Elements 2015 (Heidelberg), 2015




vissza »