A raktár által vezérelt kalciumfelszabadulás szerepe egészséges és kóros vázizomrostokban  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
108476
típus PD
Vezető kutató Sztretye Mónika
magyar cím A raktár által vezérelt kalciumfelszabadulás szerepe egészséges és kóros vázizomrostokban
Angol cím The role of store operated calcium entry in healthy and diseased mouse skeletal muscle cells
magyar kulcsszavak vázizom, myostatin, SOCE, STIM, Orai, kalciumfelszabadulás, funkcionális depléció, izomfáradás, voltage clamp, izombetegség
angol kulcsszavak skeletal muscle, myostatin, SOCE, STIM, Orai, calcium release, functional depletion, fatigue, voltage clamp, muscle disease
megadott besorolás
Biológiai rendszerek elemzése, modellezése és szimulációja (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)100 %
zsűri Élettan, Kórélettan, Gyógyszertan és Endokrinológia
Kutatóhely ÁOK Élettani Intézet (Debreceni Egyetem)
projekt kezdete 2014-01-01
projekt vége 2018-09-30
aktuális összeg (MFt) 19.722
FTE (kutatóév egyenérték) 2.47
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

A mozgásszegény életmód, az öregedés és a helytelen táplálkozás mind társíthatók az izom teljesítmény és tömeg hanyatlásával. A myostatin, egy az izmok fejlödésének erőteljes negatív szabályozó fehérjéje. A MstnCmpt-dl1Abc egerek fenotípúsosan izömtömeg növekedést mutatnak, ami a fizikai edzettségi állapot romlásával társul. Jelen projekt célja hogy meghatározza a raktár által vezérelt kalcium belépésben (SOCE) résztvevő molekulák, úgy mint STromal Interaction Molecule (STIM) és kalcium release-aktivált kalcium csatorna (Orai) szerepét az [Ca2+]SR, valamint Ca2+ felszabadulás szabályozásában, egészséges és MstnCmpt-dl1Abc egér vázizomrostokban.
A STIM1 és Orai1, valamint az elektro-mechanikai kapcsolásban résztvevő többi kulcsfehérje endogén szintjének ellenőrzése érdekében, Western Blot analízist fogok végezni kontroll és MstnCmpt-dl1Abc egerekből származó mintákon. Az előzetes eredmények alapján a STIM1 és Orai1 fehérjék szintje jelentősen lecsökken a kompakt egerek izmában. Konfokális mikroszkóppal végzett farmakológiai kísérletek is alátámasztani látszanak ezt a megfigyelést. A normál SOCE aktivitás visszaállítás érdekében, in vivo elektroporáció révén az mCherry-STIM1 és/vagy eGFP-Orai fúziósfehérjék kifejeződési szintjét, valamint ezek funkcionalitását fogom tanulmányozni. Feszültség clamp körülmények között fáradást előidéző depléciós protokollokat kívánok alkalmazni.
Az izomgyengeség sok esetben jár mitokondriális elváltozásokkal, ezért ezt az aspektust is vizsgálni fogom. Ezen kísérletek révén remélem megismerni a STIM / Orai jelátvitel lépéseit vázizmokban és azt, hogy ezek a mechanizmusok hogyan vezethetnek a megfigyelt változásokhoz.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

Míg a SOCE sokféle sejtben segít teljesíteni az alapvető funkciókat, élettani szerepe vázizomban mai napig nem teljesen tisztázott. A raktár által vezérelt csatornák jelen vannak és jelentősségel bírhatnak vázizomban, hisz bizonyítottan szerepük van az izomfejlődésben, differenciálódásban, kontraktilis funkciók és fáradékonysággal szembeni ellenállásban. Duchenne izomdisztrófiában túlműködésük jól dokumentált. Nem excitábilis sejtekben szerepük van a lassú válaszok kialakításában, valamint transzkripciós faktorok szabályozásában; izomban azt várjuk, hogy a SOCE mechanizmus rövidebb időskálán befolyásolja majd a jelátvitelt. A kulcskérdés, melyre itt választ keresek az, hogy befolyásolja-e a SOCE a belső Ca2+ raktárakat és ezáltal az elektro-mechanikai kapcsolást, különösen a raktárürítést és izomfáradást kiváltó protokollok alkalmazását követően?
Élettani körülmények között az [Ca2+]SR csökken a tartós testmozgást követően és izomfáradás alakul ki. A MstnCmpt-dl1Abc egerek fáradékonyabbak és nagyobb gyakorisággal mutatnak metabolikus acidosist, csökkent légzési és keringési funkciót vad típusú társaikkal szemben. E projekt fő célja, hogy jellemezze a kompakt egerekben a sejtszinten történő depléciós protokoll alkalmazását követően kialakuló Ca2+ felszabadulást a kontroll állatcsoporthoz képest, valamint feltárja a SOCE szerepét ezen folyamatokban. A tanulmány segíthet megérteni az [Ca2+]SR stabilitását befolyásoló tényezőket tartós Ca2+ felszabadulás mellett. A STIM/Orai jelátvitel tanulmányozása egy potenciális jelölt lehet az öregedés, valamint kóros izomfáradás gyógyításában.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

E projekt specifikus céljainak elérése jelentős szereppel bírhat az izomkutatásban. Az eredmények segíthetnek megérteni a vázizom elektro-mechanikai kapcsolat jelátviteli útvonalait és a raktár által vezérelt Ca2+ belépés folyamatát, különös tekintettel a STIM/Orai jelátvitel struktúrális és funkcionális alapjaira, egészséges, valamint kóros egér vázizmokban. A MstnCmpt-dl1Abc egerek fenotípusosan megnövekedett izomtömeggel rendelkeznek, ugyanakkor fáradékonyabbak és csökkent izomerővel jellemezhetők hosszantartó izommunka esetén.
A STIM/Orai jelátvitel alapvető biológiai szerepére utal, hogy recessziós mutációk súlyos immunhiányosságot okoznak human páciensek esetén, valamint egyidejű veleszületett myopátiát újszülött betegeken. Különböző bizonyítékok támasztják alá a STIM/Orai fontosságát vázizomban: a) a STIM1 és Orai1 fehérjék erőteljesen jelen vannak vázizomban; b) STIM1 és Orai1 prelokalizáltak az SR junkcionális membrán, valamint T-tubulusok rendszerében; c) STIM1 hiányos egerekben myopátia, fokozott nukleáció, duzzadt mitokondriumok, valamint az izomspecifikus fehérjék alacsonyabb kifejeződése (például SERCA) figyelhető meg; d) a STIM1 fehérje géncsendesítése, valamint domináns negatív Orai1 túltermelése csökkentette a SOCE mechanizmust C2C12 myotubulosokon; e) súlyos immunhiányos betegeknél (SCID) ahol jellemzően sérült a STIM/Orai jelátvitel, myopátia jelentkezik. Mindezt összegezve, egyértelműnek tűnik a STIM/Orai jelátvitel aktív szerepe különféle sejttípusokban és megalapozott annak vázizomban történő felderítése.
A Ca2+ homeosztázis MstnCmpt-dl1Abc egerek izmában történő feltárásával jelentősen bővíthetjük ismereteinket az izomgyengesség, valamint fáradékonyság hátterében álló molekuláris folymatokról. E mechanizmusok hátterének megértése segíthet potenciálisan biztonságos terápiák kifejlesztésében atrófia, öregedés és izomsorvadásos betegségek esetén.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média illetve az adófizetők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI számára.

A mozgásszervi elváltozások jelentős részének hátterében az izmok gyengülése vagy sorvadása áll. Bármilyen terápia, ami lassítani tudná az öregkori izomsorvadást vagy gyorsítani az izomsérülések utáni regenerációt, jelentős pozitív nemzetgazdasági és társadalmi hatással járna. A raktár által vezérelt Ca2+-belépés (SOCE) gyakorlatilag minden sejttípusban jelen van, és a belső raktárak ürülését (izomban szarkoplazmatikus retikulum, SR) köti össze a plazmamembránban helyezkedő Ca2+-érzékeny csatornák aktiválódásával. Valószínű, hogy fontosságal bír a kalcium raktárak fenntartásában és az izomgyengeség megelőzésében, valamint biztosítja a szükséges kalciumot az izom-specifikus génexpresszió szabályozásában. A SOCE mechanizmus két kulcsfontosságú összetevőjét nemrég azonosították. Ez egyrészről egy a kalcium depléciót érzékelő szenzor molekula (STIM), másrészt egy csatorna (Orai), amelyen keresztül a raktár újratöltése érdekében kalcium lép a sejt belsejébe az extracelluláris térből. A STIM/Orai alapvető biológiai szerepére utal az a tény, hogy a fehérjék recesszív mutációi, súlyos immunhiányos állapothoz vezetnek humán betegekben, a társult veleszületett myopátia mellett. Bár a STIM/Orai rendszer szerepe különböző sejttípusokban, nyílvánvalónak látszik, vázizomban ez a szerep máig nem teljesen tisztázott.
Abból kiindulva, hogy a SOCE mechanizmus fényt deríthet az [Ca2+]SR stabilitására hosszantartó izommunka esetén, jelen projekt célja hogy meghatározza a raktár által vezérelt kalcium belépésben résztvevő molekulák (mint STIM és Orai) szerepét az [Ca2+]SR valamint a Ca2+ felszabadulás szabályozásában, egészséges és MstnCmpt-dl1Abc egerek vázizmában.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

Sedentary lifestyle, aging, and improper diet are all associated with a decline in muscle performance and mass. Myostatin has emerged as a potent negative regulator of muscle development. MstnCmpt-dl1Abc mice exhibit a remarkable hypermuscular phenotype but the overall animal endurance is diminished. These mice are prone to fatigue and present signs of muscle weakness. The specific aim of this project is to determine the role of Store Operated Calcium Entry (SOCE) molecules such as STromal Interaction Molecule (STIM) and Calcium release-activated calcium channel protein (Orai) in control of [Ca2+]SR and Ca2+ release in healthy and MstnCmpt-dl1Abc muscle cells.
I will perform Western Blot analysis on whole muscle homogenates from control and MstnCmpt-dl1Abc mice in order to evaluate the relative amount of endogenous STIM1 and Orai1, as well as other EC coupling related proteins. Initial tests underlie a marked decline of STIM1 and Orai1 in the MstnCmpt-dl1Abc muscles. Confocal imaging of the Ca2+ movements revealed altered SOCE activity in the latter. In an attempt to restore this feature, using in vivo electroporation, the expression level and functionality of mCherry-STIM1 and/or eGFP-Orai1 (or both) fusion proteins will be assessed. In a comparative study, SOCE will be evaluated on mechanically skinned fibers also. Under voltage clamp conditions, I will test depleting protocols to induce fatigue in single muscle fibers. Muscle weakness is often linked to mitochondrial involvement, so this aspect will also be addressed. By doing so, I hope to better understand the steps of STIM/Orai signaling in muscle, and ultimately how these mechanisms lead to the observed changes.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

While SOCE helps many types of cells to fulfill their basic functions, its physiological role in skeletal muscle has not been entirely defined. Store-operated channels are present and may play a very important role in skeletal muscle physiology, ranging from roles in development, differentiation, contractile function and resistance against fatigue. Well documented is their increased activity in Duchenne Muscular Dystrophy. In non-excitable cells, SOCE is known to affect transcription factors and slow responses; in muscle we expect that it will also impact signaling on faster time scales. Can it alter the Ca2+ store at a rate sufficient to affect EC coupling, specifically under patterns of activity that lead to SR depletion and fatigue, is a key question aimed to be answered in this study.
Physiologically, [Ca2+]SR declines with sustained exercise and is a factor of “peripheral” muscle fatigue . The MstnCmpt-dl1Abc mice fatigue more readily, have greater propensity for metabolic acidosis, and impaired respiratory and cardiovascular systems. In light of this, a major goal of this project is to characterize the compact mice by causing fatigue on single fiber level and assess the changes in Ca2+ release that it entails as compared to their wild type littermates. My attention will be focused on the role of the two key players of SOCE in skeletal muscle, namely STIM1 and Orai1. I would like to prove that understanding the signaling mechanism underlying skeletal muscle EC coupling and STIM/Orai signaling could be a potential candidate as a treatment in case of muscle fatigue, ageing, or muscle wasting.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

Achieving the specific aims of this project may have significant interest for the muscle physiology field. The results will contribute to our understanding of the signaling mechanism underlying skeletal muscle EC coupling and store dependent Ca2+ influx along with the structure-function relationship in STIM/Orai signaling in healthy and diseased mouse muscles. The MstnCmpt-dl1Abc mice present a remarkable hypermuscular phenotype along with signs of loss of force production when the muscle is stimulated under fatiguing conditions.
The fundamental biological role of STIM/Orai signaling is indicated by the fact that recessive mutations lead to severe immunodeficiency in humans and concomitant congenital, nonprogressive myopathy in infant patients. Different lines of evidence support the idea that STIM1/Orai1 are critical for SOCE in skeletal muscle: a) STIM1 and Orai1 are highly expressed in skeletal muscle b) STIM1 is pre-localized at the SR junctions with the T-tubule system which contains pre-localized Orai1; c) mice lacking STIM1 display myopathy, increased central nucleation, swollen mitochondria and a decline in the muscle specific proteins in the SR, like SERCA; d) knockdown of STIM1 or expression of the dominant negative Orai1 E106Q caused a marked decline in SOCE in skeletal myotubes; e) SCID patients characterized by loss-of-function mutations in STIM1/Orai1 signaling display skeletal-muscle myopathy. Taken all these together it is clear that STIM1/Orai1 participate in a conserved calcium signaling network that is active in diverse cell types but their exact role in skeletal muscle is still obscure and needs to be investigated.
With the description of how the Ca2+ movements are altered in the MstnCmpt-dl1Abc mice we would widen our knowledge about the molecular mechanisms behind the altered muscle functions present in muscle weakness and fatigue. Understanding the underlying mechanisms of these processes could help the development of potentially safe therapies in muscle atrophy, ageing and wasting diseases.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NKFI in order to inform decision-makers, media, and the taxpayers.

Significant proportion of locomotor diseases are caused by muscle weakness or wasting. Any therapy that is able to slow down the loss of muscle mass in elderly or to accelerate the regeneration of muscles after injuries would have a great impact on social economy. Store-operated Ca2+ entry (SOCE) is a Ca2+ influx pathway present in all cells that couples the calcium depletion of internal stores (in muscle: sarcoplasmic reticulum (SR)) to the activation of plasma membrane Ca2+-permeable channels. It is likely to be important for sustaining calcium stores to prevent muscle weakness and contribute calcium needed to modulate muscle-specific gene expression. The mechanism of SOCE have two key components recently identified: first, a sensor of calcium store depletion (STIM) and second, a channel (Orai) that when activated by the calcium sensor facilitates calcium entry into the cell for store refilling. The fundamental biological role of STIM/Orai signaling is indicated by the fact that recessive mutations lead to severe immunodeficiency in humans and concomitant congenital myopathy. MstnCmpt-dl1Abc mice present a remarkable hypermuscular phenotype along with signs of muscle weakness when stimulated under fatiguing conditions. It is clear that STIM/Orai signaling network is active in various cell types but their role in skeletal muscle is still elusive.
Starting from the central hypothesis that SOCE may help explain the stability of [Ca2+]SR in the face of sustained activation of Ca2+ release, the specific aim of this project is to determine the role of SOCE in control of [Ca2+]SR and Ca2+ release in healthy and MstnCmpt-dl1Abc mouse mammalian skeletal muscle cells.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
Ebben a projektben, az SOCE mechanizmus átfogó jellemzését végeztem el a Cmpt egér modellben, ahol a SOCE szerepét vizsgáltam a vázizom kalciumraktárainak (SR) újratöltésében. A Cmpt mutáció csökkent SR kalciumtartalomhoz vezet, amely felelős lehet a kisebb specifikus erőért. A legvalószínűbb magyarázat arra, hogy hogyan vezet a mutáció ehhez a csökkenéshez, feltehetően a SOCE fehérjék (STIM1 és Orai1) expressziójának a csökkenése és ezzel párhuzamosan az alacsonyabb SOCE aktivitás. Eredményeink segítenek megoldani a régóta fennálló kérdést, hogy az SOCE-nak szerepe van-e a normális vázizom aktiválás során. Azt találtuk, hogy a SOCE szerepet játszik az SR kalciumraktárainak fenntartásában és újratöltésében, nemcsak az ismétlődő tetanikus stimulációban, hanem az azonnali terhelést követően a legújabb észrevételekkel egyetértésben. Bevezettük egy egyszerű matematikai modellt, ami képes megbecsülni a SR kiürülésének és újratöltésének időbeli lefolyását a kísérleti adatok alapján. A modell által becsült értékek összhangban voltak a mért kísérletes eredményeinkkel. Az SOCE partnerek (STIM1 és / vagy Orai1) csökkent funkciója és / vagy expressziója fontos szerepet játszhat az egyes patológiás elváltozások és az öregedéshez társuló izomgyengeségben. A kalcium-beáramlási útvonalnak feltérképezése és megismerése új és biztonságos stratégiákat nyitnak meg a szarkopénia tüneteinek enyhítésére.
kutatási eredmények (angolul)
In this project I provided a comprehensive characterization of the SOCE mechanism in the Cmpt mouse model explaining the role of SOCE in refilling the SR Ca2+ stores in skeletal muscle. The Cmpt mutation leads to reduced Ca2+ store content that could be responsible for the reduced specific force. The most likely explanation for how the mutation leads to this reduction is the reduced expression of the SOCE partner proteins and the concomitant lower SOCE activity. Our results help resolve the long-standing question whether or not SOCE has any role during normal skeletal muscle activation. We found SOCE having a role in maintaining and refilling SR Ca2+ stores not only in repetitive tetanic stimulation, as it was previously reported, but on an immediate basis in agreement with latest observations. A simple mathematical model that we’ve introduced is able to estimate the time course of SR depletion and refilling in accordance with the experimental data. Reduced function and/or expression of SOCE partners (STIM1 and/or Orai1) could play an important role in muscle weakness associated to certain pathologies and aging. Tackling this calcium influx pathway could thus open novel and safe strategies to alleviate the symptoms of sarcopenia.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=108476
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
Mónika Sztretye, Nikolett Geyer, János Vincze, Dána Al-Gaadi, Tamás Oláh, Péter Szentesi, Gréta Kis, Miklós Antal, Ildikó Balatoni, László Csernoch, Beatrix Dienes: Store-operated calcium entry is important for maintaining sarcoplasmic calcium content and release in mammalian skeletal muscle fibers, Biophysical Journal, 2017
Mónika Sztretye, Péter Szentesi, László Csernoch, Beatrix Dienes: Expression of Orai1 Restores Normal Sarcoplasmic Calcium Release in Cmpt Mice, Biophysical Journal 114 (3), 41a, 2018
Mónika Sztretye, Nikolett Geyer, János Vincze, Dána Al-Gaadi, Tamás Oláh, Péter Szentesi, Gréta Kis, Miklós Antal, Ildikó Balatoni, László Csernoch, Beatrix Dienes: Store-operated calcium entry is important for maintaining sarcoplasmic calcium content and release in mammalian skeletal muscle fibers, Biophysical Journal, 2017
Mónika Sztretye, Nikolett Geyer, Dana AlGhaadi, Dóra Bodnár, Tamás Oláh, Beatrix Dienes, Ildikó Balatoni, Péter Szentesi, László Csernoch: The Mstn-Cmpt Dl1Abc-Mice. A Mouse Model to Study Muscle Weakness, Fatigue and Soce, Biophysical Journal Volume 106, Issue 2, Supplement 1, 28 January 2014, Pages 128a–129a, 2014
Mónika Sztretye: A hypermuscular mouse model to study SOCE and muscle fatigue, ACTA PHYSIOLOGICA 211, 3-3, 2014
Bodnár D, Geyer N, Ruzsnavszky O, Oláh T, Hegyi B, Sztretye M, Fodor J, Dienes B, Balogh Á, Papp Z, Szabó L, Müller G, Csernoch L, Szentesi P.: Hypermuscular mice with mutation in the myostatin gene display altered calcium signalling, J Physiol. 2014 Mar 15;592(Pt 6):1353-65. doi: 10.1113/jphysiol.2013.261958. Epub 2014 Jan 20., 2014




vissza »