A TRESK és TASK K2P csatornák molekuláris partnerei, szabályozása és fiziológiás funkciói  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
108496
típus K
Vezető kutató Enyedi Péter
magyar cím A TRESK és TASK K2P csatornák molekuláris partnerei, szabályozása és fiziológiás funkciói
Angol cím Molecular interacting partners, regulation and physiological roles of TRESK and TASK K2P potassium channels
magyar kulcsszavak TRESK, TASK, háttér kálium csatorna, kalcineurin, 14-3-3, jelátviteli komplex
angol kulcsszavak TRESK, TASK, background potassium channel, calcineurin, 14-3-3, signalling complex
megadott besorolás
Sejtdifferenciálódás, sejtélettan, sejtdinamika (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)100 %
zsűri Élettan, Kórélettan, Gyógyszertan és Endokrinológia
Kutatóhely Élettani Intézet (Semmelweis Egyetem)
résztvevők Braun Gabriella
Czirják Gábor
Hegedűs Tamás Zoltán
Könczöl Katalin
Lengyel Miklós
Tóth Zsuzsanna
projekt kezdete 2013-10-01
projekt vége 2018-09-30
aktuális összeg (MFt) 27.837
FTE (kutatóév egyenérték) 7.80
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

A háttér kálium csatornák fő meghatározói a sejt membránpotenciáljának. Működésüket környezeti tényezők, intracelluláris jelátviteli folyamatok, továbbá a klinikumban használt szerek is befolyásolják. Egyik képviselőjük, a TRESK elsősorban idegsejtekben fejeződik ki. Jelentőséget tulajdonítanak e csatornának a fájdalomérzés modulálásában, mutációját pedig összefüggésbe hozták gyakori migrénes rohamok egyik formájával.
Klónozását követően a TRESK szabályozásának számos vonatkozását munkacsoportunk tisztázta: kalcium mobilizáló agonistákkal való aktiválását, ebben a kalcineurin szerepét, azonosítottuk a csatornát foszforiláló és ezáltal gátló kinázokat, továbbá kölcsönhatását intracelluláris partner fehérjékkel (kalcineurin, 14-3-3)
Kimutattuk, hogy a TRESK erősen kötődik egy citoszkeletális fehérjéhez. Tisztázni szeretnénk, hogy e kölcsönhatás közvetlenül befolyásolja-e a csatorna aktivitását, hozzájárul-e egy összetettebb jelátviteli egység kialakulásához vagy szerepet játszik-e abban, hogy a csatorna a sejt a megfelelő kompartmentjébe kerüljön. Két K2P csatorna közelmúltban publikált kristályszerkezete alapján TRESK homológia modellt készítettünk. E modellt felhasználva tervezünk olyan irányított mutációkat létrehozni, melyek hozzásegítenek a csatorna aktivációjának jobb megértéséhez, és a szerkezeti elemek azonosításához, melyek szerepet játszanak gátlószerek kötődésében. A génmódosítás egy új lehetőségét, a TALEN módszert alkalmazva TRESK knock out egérmodellt tervezünk létrehozni a csatorna fiziológiás funkciójának tanulmányozására. Megkíséreljük a natív gént egy módosított epitop-jelölt formára is lecserélni, ami megbízható immunológiai detektálást tesz lehetővé.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

A háttér (K2P) K+ csatornák a membránpotenciál és az ingerlékenység meghatározói számos sejttípusban. A TASK alcsalád tagjainak alapvető szerepe mára elfogadottá vált a gerincvelői motoneuronok, kisagyi szemcsesejtek és a mellékvesekéreg glomerulóza sejtjeiben. Más K2P csatornákról, pl. a szekvencia és funkció tekintetében is különálló TRESK-ről, jóval kevesebbet tudunk. A TRESK mRNS megtalálható hátsó gyöki és vegetatív idegrendszeri ganglion neuronokban és nem publikált eredményeink szerint kisagyi Purkinje sejtekben is. Munkánk egyik célja, hogy a TRESK csatorna élettani jelentőségéről képet alkossunk. Ezért szeretnénk megvizsgálni a Purkinje neuronok háttér K+ csatorna repertoárját, illetve génmódosított egerek felhasználásával a TRESK szubcelluláris lokalizációját. Szerencsés esetben a génmódosított egerek ötletet adhatnak a csatorna élettani funkcióját illetően.
A TASK és TRESK csatornák egyaránt receptor-mediált szabályozás célpontjai. A TASK-1 és -3 csatornákat gátolja a Gq-fehérjéhez kapcsolt receptorok ingerlése, míg a TRESK csatornát aktiválja. Az elmúlt évtizedben munkacsoportunk jelentősen hozzájárult ezeknek a mechanizmusoknak a feltárásához, azonban a szabályozások számos alapkérdése megválaszolatlan maradt. Újabb támpontot adhatna, ha eddig nem ismert partner fehérjé(ke)t tudnánk azonosítani a TASK csatornákhoz. A TRESK esetében egy újabban talált (még nem publikált) citoszkeletális TRESK partnerfehérje csatornára kifejtett hatását szeretnénk elsősorban tisztázni. Mindemellett, jelentős előrelépés lenne, ha a TRESK-reguláló MARK kinázok és a csatorna közelmúltban általunk leírt interakcióját és magának a TRESK-nek a kapuzó működését jobban megértenénk.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

A pályázatban tervezett kutatások alapkutatás jellegűek. A várható eredmény elsősorban a TASK és TRESK csatornák működésének és élő szervezetben betöltött szerepének jobb megértése. A TASK csatornák széles körben kifejeződnek az idegrendszerben és a periférián egyaránt, így gyógyszercélpontként való felhasználásuk kevéssé tűnik valószínűnek. Ezzel szemben a TRESK jóval körülírtabb szöveti kifejeződést mutat. A közelmúltban a TRESK inaktiváló mutációját egy nagy migrénes család beteg tagjaiban azonosították, ezért felvetődött, hogy a csatorna a migrénes kórfolyamat normál ellensúlyozója (Nature Medicine, 2010). Ezzel kompatibilis a csatorna lokalizációja, hiszen igen nagy mennyiségben található a trigeminus ganglionban, melynek szerepe a migrénben kétségtelen. Martin Mackay (akkoriban a Pharma Therapeutics R&D (Pfizer) elnöke) 2010 januári, az interneten elérhető előadásanyagának tanúsága szerint a Pfizer gyógyszergyár potenciális terápiás célpontnak tekintette a TRESK-et és a csatornát nyitó hatóanyag kifejlesztésébe kezdett. Ettől az utalástól eltekintve azonban több információval nem rendelkezünk erről a kezdeményezésről. Nyilvánvaló azonban, hogy az ismereteink jelen szintjén, az újabb alapkutatási adatok lényegesen befolyásolják az alkalmazás lehetőségét és annak megítélését. Például azóta olyan adatok láttak napvilágot, melyek szerint a TRESK nagy mennyiségben kifejeződik a vegetatív idegrendszer ganglion sejtjeiben is, illetve, hogy találtak inaktiváló TRESK mutációval élő, nem migrénes egyéneket. Pillanatnyilag nehéz megítélni, hogy egy általános TRESK aktiváló hatóanyag milyen élettani hatásokat fejtene ki, enyhítené-e a migrénes rohamot és nem okozna-e életveszélyes vegetatív diszfunkciót. Eddigi saját kutatási adataink hozadéka, hogy a TRESK csatornának létezik jelátviteli folyamatok által erőteljesen aktivált, illetve gátolt formája, és a két forma farmakológiásan elkülöníthető (mi az egyébként TRESK-re nem specifikus benzokaint használtuk erre kísérleti körülmények között). Ez egy újabb lehetséges dimenziót jelent az alkalmazott kutatás számára, hiszen elvileg kifejleszthetők TRESK aktivitástól függően ható farmakonok.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média illetve az adófizetők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI számára.

A sejtmembrán elektromos tevékenységének fontos tényezői a kálium csatornák. Minden sejtben megtalálhatóak, szerkezetük és szabályozásuk is igen változatos. A háttér (K2P) kálium csatornák döntő jelentőségűek a sejtmembrán nagy nyugalmi K+ vezetőképességének létrejöttében. Működésüket környezeti tényezők, intracelluláris jelátviteli folyamatok, valamint a gyógyászatban alkalmazott számos szer befolyásolhatja.
Az általunk tanulmányozott ioncsatorna - a TRESK – is a háttér K+ csatornák közé tartozik. Jelenleg azonban senki sem érti pontosan, hogy mi a TRESK feladata az élő szervezetben. Ismert viszont, hogy jelen van a fájdalomérző idegsejtekben, az életfontos funkciókat (pl. szívverést) szabályozó vegetatív idegsejtekben és sejtésünk szerint a kisagyi, mozgást koordináló Purkinje idegsejtekben is. Genetikai hiányát pedig kapcsolatba hozták a migrénes fejfájás egyik fajtájának halmozott előfordulásával. Az elmúlt évtizedben mi mutattuk ki, hogy a sejtekben hogyan szabályozódik a TRESK csatorna: aktiválódik, ha a kalcineurin enzim foszfát csoportokat hasít le róla. Általunk azonosított protein kinázok pedig foszforilálják, ezzel gátolják a működését.
Jelen pályázatunkban három irányban szeretnénk folytatni kutatásainkat. Észrevettük, hogy a sejtváz egyik fehérjéje hozzákapcsolódik a TRESK csatornához, és ki szeretnénk deríteni, ez milyen célt szolgál. Betekintést szeretnénk nyerni a csatorna nyitó-záró működésébe atomi szinten. Emellett olyan kísérleti állatot (egeret) tervezünk létrehozni, melyben a TRESK csatorna hiányzik, vagy módosított formában van jelen, és ennek segítségével a csatorna elhelyezkedése a sejtekben, illetve szerepe a szervezetben felderíthető.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

Background K+ channels are major determinants of the membrane potential of the cells. They are regulated by environmental factors, intracellular signaling mechanisms and also by clinically used drugs. One of their representatives, TRESK is predominantly expressed in neurons. It has been suggested that TRESK contributes to pain sensation and its mutation has been related to frequent migraine attacks.
After cloning TRESK we have uncovered several aspects of its regulation: its activation by Ca2+ mobilizing agonists (their effect is mediated by calcineurin), kinases (PKA and MARK) which phosphorylate and inhibit the channel and its interaction with intracellular partners (calcineurin and 14-3-3).
We have also recognized that TRESK avidly binds to a cytoskeletal protein and we plan to elucidate whether this interaction directly affects channel activity, establishes the assembly of a more complex signaling unit or it is involved in the intracellular targeting of the channel. Based on the recently published crystal structure of two K2P channels we have constructed a TRESK homology model. By applying this model, we plan to perform site directed mutagenesis to gain more insight into the mechanism of activation and to identify structures which contribute to the pharmacological inhibition/activation of TRESK by different drugs. Taking advantage of the recently published TALEN method we plan to develop a TRESK knock out mouse model to address the physiological function of the channel. We will also attempt to substitute the native gene with a modified, epitope-tagged version of TRESK which will be suitable for reliable and accurate immunological detection.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

Background K+ (K2P) channels are major determinants of the membrane potential and excitability in several cell types. The importance of TASK channels in spinal cord motoneurons, in cerebellar granule cells and in the adrenal glomerulosa cells has been experimentally confirmed. Our knowledge is more limited regarding other K2P channels, especially in the case of TRESK, which has a unique structure and regulation. TRESK mRNA is present in the dorsal root-and vegetative ganglia and as is shown by our unpublished results also in cerebellar Purkinje cells. One aim of the planned studies is to obtain information about the physiological significance of the channel. Therefore we plan to map the background K+ channel repertoire of Purkinje cells and taking advantage of TRESK knock out mice we plan to analyze the subcellular localization of the channel. Gene modified mice may also turn out to be valuable tools in new functional studies.
Both the TASK and TRESK channels are targets of receptor mediated regulation. TASK-1 and TASK-3 are inhibited, while TRESK is activated by Gq-coupled receptors. In the last decade our group significantly contributed to the elucidation of these regulatory mechanisms, however, several basic questions concerning these regulations are still unanswered. Discovery of new interacting protein partners of TASK would provide new clues in this regard. In the case of TRESK we plan to analyze the functional significance of a recently recognized cytoskeletal protein partner. We expect significant advance in the understanding of the interaction of TRESK and MARK kinases (which we published recently) and in the mechanism of the gating of the channel.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

The planned studies of this grant application should be regarded as basic research. The expected results are hoped to provide a better understanding of TASK and TRESK channel regulation and function in the living organism. TASK channel expression is widespread in the nervous system and also in peripheral tissues; therefore targeting them therapeutically probably raise more questions of potential side effects. On the other hand tissue expression of TRESK is more restricted.
According to a recent report, inactivating mutation of TRESK has been identified in the affected members of a large family with frequent migraine attacks. This raised the possibility that the channel may counteract the disease processes of migraine
(Nature Medicine, 2010). Tissue localization of the channel appears to be compatible with this assumption as TRESK is expressed abundantly in trigeminal ganglia which have definite role in the pathogenesis of migraine. Martin Mackay (president of Pharma Therapeutics R&D, Pfizer; at that time) listed a potential TRESK opener among ”high impact medicines” in a pharmaceutical presentation (also accessible on the internet) in January 2010. Apart from this reference we have no further information about this proposal. It is obvious, however, that at the present level of our knowledge, results from basic science will profoundly affect the potential of application and its appreciation. Since then data were published about TRESK expression in neurons of the vegetative ganglia and also about inactivating TRESK mutations without migraine consequence. Therefore it is difficult to judge the consequence of general activation of TRESK; whether it would alleviate migraine symptoms or it would cause vegetative dysfunction. Our results have also highlighted another aspect of this problem; we have shown that TRESK may be activated or inhibited by endogenous signaling mechanisms, and the two states of the channel can be distinguished pharmacologically. (For this purpose, we have used the benzocaine in our experiments, which is not selective for TRESK) .This observation may give an additional clue for applied science, indicating that it might be worth searching for activity-dependent pharmacological agents.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NKFI in order to inform decision-makers, media, and the taxpayers.

Potassium channels have major impact on the electric properties of the cell membrane. They are present practically in every cell of the body. Their structure shows large variations which is also reflected in their diverse regulation. Background (K2P) potassium channels are important in setting the high resting K+ conductance and hence the membrane potential of the cell. Their activity is influenced/regulated by environmental factors, intracellular signaling mechanisms and also by clinically used drugs.
TRESK, the channel we have been studying, belongs to the background K+ channels. At present it is still not completely understood what is the exact function of TRESK in the living organism. It is known, however, that the channel is present in pain sensory neurons, in the cells of the autonomic nervous system which regulate vital functions (such as the heartbeat) and, in our assumption, also in cerebellar Purkinje cells which coordinate motor activity. Genetic defect of the TRESK channel has been associated with one type of migraine disease. In the last decade we showed that TRESK is activated by calcineurin (a unique phosphatase), while its phoshorylation by specific kinases has the opposite effect.
We continue our studies in three directions. We noticed that a cytoskeletal protein binds to TRESK and we plan to elucidate the consequences of this interaction. The experiments will facilitate deeper insight into the gating (closing/opening) of the channel at the atomic level. We plan to generate animal models, in which TRESK is absent or is expressed in a modified form. They will support functional studies and more accurate localization of the channel in the body.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
A pályázat keretében a K2P háttér kálium csatornák (elsősorban a szenzoros neuronokban expressszálódó TRESK és TREK) szabályozását, expresszióját és funkcióját vizsgáltuk. Kimutattuk, hogy a humán TRESK calcium szignállal történő szabályozásában szereplő foszfatáz, a kalcineurin az aktiváció során kötődik a csatorna intracelluláris hurokrégiójának LQLP (NFAT-szerű) motívumához. Ugyancsak leírtuk a csatorna kölcsönhatását egy másik intracelluláris fehérje partnerrel, a tubulinnal. A TRESK szabályozásának farmakológiai vizsgálatát elősegítő aktivátor, a cloxyquin hatásmechanizmusát tisztáztuk, és számos cloxyquin analógot szintetizáltunk, melyek között a csatornát specifikusan gátló vegyületeket is azonosítottunk. Ezek, valamint a pályázat támogatásával létrehozott TRESK génhiányos egér segítségével analizáltuk a TRESK hozzájárulását a fájdalomérzés közvetítésében is szerepet játszó hátsó gyöki szenzoros ganglion sejtek érzékenységének beállításához. Kimutattuk, hogy e sejtekben a TRESK és egy ruténuim vörös-érzékeny (a TREK családba tartozó) K2P csatorna az ingerlékenységet jelentős mértékben meghatározó tényező. Kimutattuk, hogy a TREK csatorna család két közeli rokon tagja ruténium vörössel farmakológiailag is elkölöníthető egymástól, továbbá, hogy a TREK1 és a TREK-2 heterodimert képes létrehozni ezáltal is növelve a K2P csatornák diverzitását.
kutatási eredmények (angolul)
In the frame of the recent project we have studied the regulation, expression and function of different K2P background potassium channels, focusing on TRESK and on members of the TREK family. We have shown that calcineurin, the calcium-reglated phophatase, which activates TRESK during a calcium signal has to bind to an LQLP (NFAT-like) motif on the channel to exert its effect. We have also characterized the interaction of TRESK with another intracellular protein partner, tubulin. We have clarified the mode of action of the channel activator cloxyquin what can be can be used in pharmacological studies addressing the physiological/pathological significance of TRESK. We have created several cloxyquin analogues and identified among them specific TRESK inhibitors. Utilizing these pharmacological tools and also the TRESK gene-deficient mouse (created with the support of the project), we analyzed the contribution of TRESK to the sensitivity of dorsal root ganglion cells that are involved in the transmission of pain sensation. We have shown that in these cells TRESK and a ruthenium red-sensitive K2P channel (a member of the TREK family) are major determinants of excitability. Finally, we have shown that two closely related members of the TREK family can be unequivocally distinguished pharmacologically, using ruthenium red, furthermore these two channel subunits (TREK1 and TREK2) are able to form functional heterodimers thereby increasing the diversity of K2P channels.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=108496
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
Enyedi P, Veres I, Braun G, Czirják G.: Tubulin binds to the cytoplasmic loop of TRESK background K⁺ channel in vitro, PLoS One. 2014 May 15;9(5):e97854, 2014
Czirják G, Enyedi P.: The LQLP Calcineurin-docking Site Is a Major Determinant of the Calcium-dependent Activation of Human TRESK Background K+ Channel., J Biol Chem. 2014 Sep 8. pii: jbc.M114.577684. [Epub ahead of print], 2014
Enyedi Péter, Braun Gabriella, Lengyel Miklós, Hegedűs Tamás, Czirják Gábor: Háttér kálium csatornák ruténium vörös (RR) érzékenységének vizsgálata, 44. MEMBRÁN-TRANSZPORT KONFERENCIA (Sümeg), 2014
Gabriella Braun, M. Lengyel, P. Enyedi, T. Hegedűs, G. Czirják: Ruthenium red differentiates between closely related K2P channels, Joint meeting of FEPS and the Hungarian Physiological Society in 2014, 2014
G. Czirják, G. Braun, P. Enyedi: TRESK background K+ channel is regulated by calcineurin and other interacting proteins, Joint meeting of FEPS and the Hungarian Physiological Society in 2014, 2014
Czirják G, Enyedi P.: Properties, regulation, pharmacology, and functions of the K₂p channel, TRESK., Pflugers Arch. 2015 May;467(5):945-58., 2015
Braun G, Lengyel M, Enyedi P, Czirják G.: Differential sensitivity of TREK-1, TREK-2 and TRAAK background potassium channels to the polycationic dye ruthenium red., Br J Pharmacol. 2015 Apr;172(7):1728-38., 2015
Miklós Lengyel, Gábor Czirják, and Péter Enyedi: Formation of Functional Heterodimers by TREK-1 and TREK-2 Two-pore Domain Potassium Channel Subunits., J Biol Chem. 2016 Jun 24;291(26):13649-61., 2016
Lengyel M, Dobolyi A, Czirják G, Enyedi P.: Selective and state-dependent activation of TRESK (K2P 18.1) background potassium channel by cloxyquin., British Journal of Pharmacology 2017 Jul;174(13):2102-2113, 2017
Lengyel M, Czirják G, Enyedi P.: TRESK background potassium channel is not gated at the helix bundle crossing near the cytoplasmic end of the pore., PLoS One. 2018 May 15;13(5):e0197622. doi: 10.1371/journal.pone.0197622. eCollection 2018., 2018





 

Projekt eseményei

 
2015-12-17 08:29:37
Résztvevők változása




vissza »