A ligandumkötődés mechanizmusának vizsgálata a humán epesav-kötő fehérjében  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
109035
típus K
Vezető kutató Tőke Orsolya
magyar cím A ligandumkötődés mechanizmusának vizsgálata a humán epesav-kötő fehérjében
Angol cím Investigation of the mechanism of ligand binding in human ileal bile acid binding protein
magyar kulcsszavak fehérje-ligandum kölcsönhatás, molekuláris felismerés, fehérje szerkezet és dinamika, konformációs átmenet, kooperativitás, NMR spektroszkópia
angol kulcsszavak protein-ligand interaction, molecular recognition, protein structure and dynamics, conformational transition, cooperativity, NMR spectroscopy
megadott besorolás
Szerkezeti biológia (krisztallográfia és elektronmikroszkópia) (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)70 %
Biofizika (pl. transzport-mechanizmusok, bioenergetika, fluoreszcencia) (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)30 %
Ortelius tudományág: Molekuláris biofizika
zsűri Molekuláris és Szerkezeti Biológia, Biokémia
Kutatóhely Szerves Kémiai Intézet (Természettudományi Kutatóközpont)
résztvevők Bencsura Ákos
Bóta Attila Géza
Fizil Ádám
Horváth Gergő
Lejtoviczné Egyed Orsolya
projekt kezdete 2014-02-01
projekt vége 2019-01-31
aktuális összeg (MFt) 23.834
FTE (kutatóév egyenérték) 9.67
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

A vékonybél távoli szakaszában termelődő humán epesav-kötő fehérje (I-BABP) kulcsszerepet tölt be az epesavak metabolikus célbajuttatásában. Az epesavak azon túlmenően, hogy segítik a zsírok, zsírban oldódó vitaminok felszívódását a szervezetben, fontos szerepet játszanak a metabolikus folyamatok, például a koleszterinszint szabályozásában. Az intracelluláris lipidkötő fehérjék családjába tartozó I-BABP két kötőhellyel rendelkezik, amelyek között kötőhely szelektivitással párosuló pozitív kooperativitás működik. Az epesavak kötődési mechanizmusát illetően sok a nyitott kérdés. Többek között tisztázatlan miként jutnak be a ligandumok a fehérje belsejében található kötőüregbe, és miként távoznak onnan. Úgyszintén keveset tudunk a kötőhelyek közötti kommunikáció molekuláris részleteiről. A közelmúltban NMR spektroszkópiai vizsgálatok segítségével azonosítottunk egy lassú, ms időskálán zajló belső mozgást a fehérjében, amely komplexálódás hatására mérséklődik. E vizsgálatok korábbi kinetikai mérésekkel összhangban a konformációs fluktuációk fontosságára utalnak a fehérje működésében. Az I-BABP-epesav kölcsönhatás mechanizmusának részletes felderítése érdekében pályázatunkban célul tűzzük ki a ligandumkötődés szerkezeti és dinamikai aspektusainak feltárását nagyfelbontású NMR spektroszkópiai, molekuláris biológiai, és biofizikai (ITC, stopped-flow fluoreszcencia) technikák együttes alkalmazásával. Mivel az epesavak enterohepatikus körforgása során az I-BABP fehérje kulcsszerepet játszik az epesavaknak a bél hámsejtjeiben zajló membrán-transzport folyamataiban, tanulmányozni kívánjuk a lipid kettősréteg szerepét az I-BABP-epesav kölcsönhatásban.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

Kutatásunk fő célkitűzése a humán I-BABP-epesav kölcsönhatás mechanizmusának molekuláris szinten történő megértése. Vizsgálataink során két fő kérdésre kívánunk összpontosítani: 1) Miként jutnak be az epesavak a kötőüregbe, illetve miként távoznak onnan? 2) Mi az információáramlás útja a két kötőhely között? Korábbi NMR spektroszkópiai és biofizikai vizsgálataink alapján az epesavak kötődésében allosztérikus tényezők szerepe valószínűsíthető. Hipotézisünk szerint a fehérje két jól elkülönülő konformációs állapottal rendelkezik: egy nyitott (T) és egy zárt (R) formával. Míg a szabad fehérje számára a termodinamikailag kedvezőbb állapot a T, ligandumkötődés hatására az egyensúly az R állapot irányába tolódik. Céljaink között szerepel az R forma stabilizálódásáért felelős kölcsönhatások azonosítása. Ezzel párhuzamosan, az I-BABP fehérjében zajló konformációs fluktuációk kinetikai, termodinamikai és szerkezeti jellemzésére irányuló NMR mérések segítségével szeretnénk atomi szintű képet alkotni a funkcionalitás szempontjából meghatározó dinamikai folyamatokról. Vizsgálni kívánjuk többek között a pH, a hidrofób kölcsönhatások, valamint az epesavak OH-csoport mintázatának szerepét a ligandumkötődést kísérő dinamikai folyamatokban, melyhez NMR spektroszkópiai, biofizikai és mutagenezis vizsgálatokat tervezünk. Ezzel párhuzamosan az epesavak enterohepatikus körforgásában meghatározó membrán-transzport folyamatok megértése érdekében oldat- és szilárdfázisú NMR módszerek kombinációjával szeretnénk betekintést nyerni az I-BABP-epesav-membrán kölcsönhatás atomi részleteibe.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

Az epesavak amfipatikus molekulák, amelyek koleszterinből szintetizálódnak a májban, majd a vékonybélbe jutva segítik a zsírszerű anyagok felszívódását a szervezetben. Az emésztésben betöltött szerepükön kívül fontos szignál molekulák is egyben. Receptor fehérjékkel történő kölcsönhatások és jelátviteli kaszkádok aktiválása révén kulcsszerepet játszanak az anyagcsere folyamatok szabályozásában. A nukleáris farnezoid receptorhoz (FXR) kötődve például részt vesznek saját maguk szintézisének és transzportjának kontrollálásában, amely a koleszterinszint fenntartásának egyik elengedhetetlen feltétele. Úgyszintén szerepük van a triglicerid, energia és glükóz metabolizmusban. Sokoldalú biológiai funkciójukból adódóan az epesavak anyagcsere- és transzportfolyamatainak molekuláris szinten történő megértése kulcsfontosságú az orvostudomány és a gyógyszeripar számára. A vékonybél távoli szakaszában, az ileumban termelődő humán epesav-kötő fehérje (I-BABP) kulcsszerepet tölt be az epesavak metabolikus célbajuttatásában. A humán I-BABP-epesav kölcsönhatás mechanizmusának felderítésére irányuló vizsgálatok a jövőben új lehetőségeket kínálhatnak az anyagcsere rendellenességek (pl. hiperlipidémia, elhízás, érelmeszesedés, 2-es típusú diabetesz) kezelésében és megelőzésében, valamint az I-BABP állványzatán alapuló szállítófehérjék tervezésében. Ezen túlmenően, a tervezett vizsgálatok általánosságban hozzájárulnak a molekuláris felismerési folyamatok, különös tekintettel a flexibilitás és funkció kapcsolatának jobb megértéséhez a fehérje-ligandum kölcsönhatásokban.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média illetve az adófizetők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI számára.

Az epesavak koleszterinből szintetizálódnak a májban. Elsődleges feladatuk a zsírszerű anyagok felszívódásának elősegítése a szervezetben, de ezen kívül fontos szerepük van az anyagcsere folyamatok szabályozásában. Ennek megfelelően az epesavak által kontrollált metabolikus útvonalak ígéretes célpontjai az anyagcsere rendellenességek (pl. érelmeszesedés, 2-es típusú cukorbetegség) kezelésének. Sokoldalú biológiai funkciójukból adódóan anyagcsere- és transzportfolyamataik molekuláris szinten történő megértése kulcsfontosságú az orvostudomány és a gyógyszeripar számára. A humán epesav-kötő fehérje (I-BABP) feladata, hogy az epesavakat a megfelelő időben a megfelelő helyre juttassa a szervezetben. Az I-BABP-epesav kölcsönhatás mechanizmusát illetően sok a tisztázatlan kérdés. Nem világos többek között miként jutnak be az epesavak a fehérje kötőüregébe, illetve miként jutnak ki onnan. Az epesavak kötődése szempontjából fontos tényező az is, hogy a fehérje két kötőhellyel rendelkezik, amelyek között pozitív kooperativitás működik. Korábbi vizsgálataink alapján a kötődésben fontos szerepe van a fehérjében zajló belső mozgásoknak. Hogy teljességében értsük a fehérje biológiai funkcióját, elengedhetetlen az I-BABP-epesav kölcsönhatás mechanizmusának atomi szintű ismerete. Ennek érdekében vizsgálatainkhoz a napjainkban elérhető legmodernebb szerkezetkutatási, biofizikai és molekuláris biológiai technikákat kívánjuk felhasználni, amelyeknek alkalmazása záloga a kutatás sikerének. Vizsgálataink új lehetőségeket teremthetnek az anyagcsere rendellenességek gyógyításában és megelőzésében, valamint hozzájárulnak a fehérjékben zajló molekuláris felismerési folyamatok jobb megértéséhez.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

Human ileal bile acid-binding protein (I-BABP) has a key role in the cellular trafficking and metabolic regulation of bile salts. The latter, in addition to aiding the absorption of lipidlike compunds in the human body, play important roles in the regulation of metabolic processes such as the maintenance of cholesterol homeostasis. As a member of the family of intracellular lipid binding proteins, I-BABP has unique properties. It has two binding sites, each of low intrinsic affinity but exhibiting a moderate-to-high level of positive cooperativity. In addition, the protein exhibits a high degree of site selectivity in its interactions with di- and trihydroxy bile salts. The mechanism of bile salt binding to human I-BABP is not fully understood. Recently we have identified a slow internal motion in the protein on the ms timescale, which ceases upon complexation. These measurements with previously obtained kinetic data suggest that conformational fluctuations have an important role in the binding process. To obtain a thorough understanding of I-BABP-bile salt interaction, with a particular emphasis on the mechanism of ligand entry/release and the communication between the two binding sites, we propose to elucidate the structural and dynamic determinants of ligand binding in I-BABP by using high-resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy in combination with molecular biology methodologies, and biophysical tools such as isothermal titration calorimetry (ITC) and stopped-flow fluorescence techniques.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

The main goal of the proposed research is to obtain a mechanistic view on I-BABP-bile salt interaction. Specifically, there are two main questions of the proposed research: 1) How do bile salts access and leave the binding cavity? 2) How is information transmitted between the two binding sites? On the basis of previous NMR spectroscopic and biophysical measurements, we hypothesize an allosteric mechanism of bile salt binding, the details of which are not yet fully clear. According to our hypothesis there are two distinct conformational states of the protein: an open (T) and a closed (R) state, from which T is thermodynamically favored in free I-BABP, whereas upon ligand binding, the equilibrium is shifted toward the R state. One of our goals is to identify the key interactions responsible for the stabilization of the R state. NMR relaxation experiments aimed at the kinetic, thermodynamic and structural characterization of conformational fluctuations will be performed to obtain an atomic level picture of functionally relevant dynamic events in I-BABP. The role of pH, hydrophobic interactions and the effect of bile salt hydroxylation pattern will be investigated in dynamic processes accompanying ligand binding by NMR spectroscopic and biophysical measurements in conjunction with mutagenesis studies. As during the enterohepatic circulation of bile salts I-BABP is known to interact with the membrane of enterocytes, the modulating role of lipid bilayers in bile salt binding and release will be studied by the combination of solution- and solid-state NMR.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

Bile salts are amphipathic molecules synthesized from cholesterol in the liver, which in the small intestine facilitate the absorption of dietary lipids, cholesterol, and fat-soluble vitamins. Besides their role in digestion, they are also known as signal molecules. By interaction with receptor proteins and activating various signaling pathways, they play a role in the regulation of metabolic processes. For instance, by binding to the nuclear farnesoid receptor (FXR), they provide a negative-feedback regulation for their own synthesis and transport, which is critical for the maintenance of whole-body cholesterol homeostasis. Additionally, they have been found to have a role in triglyceride, energy, and glucose metabolism. Given the important role of bile acids, the study of their transport at a molecular level is of special medical and pharmacological interest. Human ileal bile acid-binding protein (I-BABP) is an intracellular carrier of bile salts in enterocytes and has a determining role in their metabolic regulation and targeting. The proposed work should provide us with a mechanistic insight of I-BABP-bile salt interactions, with a special emphasis on ligand entry/release and positive binding cooperativity, which may open up new possibilities and strategies for the treatment and prevention of metabolic diseases (e.g. obesity, hyperlipidaemia, type II diabetes, atherosclerosis) and in the design of I-BABP-based carrier proteins with specific biomedical applications. In addition, the studies we propose will contribute to a better understanding of molecular recognition mechanisms in general, with particular emphasis on the role of flexibility in protein function.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NKFI in order to inform decision-makers, media, and the taxpayers.

Bile salts are synthesized from cholesterol in the liver, which in the small intestine facilitate the digestion of lipidlike compounds. In addition, they have key roles in the regulation of metabolic processes. Accordingly, bile acid-controlled metabolic pathways are promising novel drug targets to treat common metabolic diseases such as atherosclerosis and type II diabetes. Given the functional importance of bile salts, the study of their transport at a molecular level is of special medical and pharmacological interest. Human ileal bile acid-binding protein (I-BABP) is an intracellular carrier of bile salts in cells of the small intestine and has a determining role in their regulation and targeting. The mechanism of bile salt binding to human I-BABP is not fully understood. For instance, it is not known how bile salts enter and leave the binding cavity located inside of the protein. Also, there are two binding sites in I-BABP, which appear to communicate with each other via a mechanism not yet clear. Previous studies indicate that internal motions in the protein have key roles in the binding process. To understand how I-BABP functions in the human body, a structural and dynamic description of the I-BABP-bile salt interaction is necessary on the atomic level. To achieve this goal we propose to use the combination of state-of-the-art biophysical techniques such as magnetic resonance spectroscopy (NMR) in combination with molecular biology methodologies. The proposed research may open up new possibilities for the treatment and prevention of metabolic diseases and will contribute to a better understanding of molecular recognition mechanisms in proteins.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
A vékonybél távoli szakaszában termelődő humán epesav-kötő fehérje (I-BABP) kulcsszerepet tölt be az epesavak enterohepatikus körforgásában. Projektünk fő célkitűzése a humán I-BABP-epesav kölcsönhatás szerkezeti és dinamikai meghatározóinak mélyebb megértése volt, különös tekintettel a ligandumok bejutására a fehérje belsejében található kötőzsebbe. Munkánk során megmutattuk, hogy a fehérjében ms időskálán zajló belső mozgásoknak kiemelt szerepe van a kötődés mechanizmusában. Ennek részeként pH-függő relaxációs diszperziós NMR vizsgálatokkal összefüggést mutattunk ki a fehérjében található hisztidin aminosavak protonáltsági állapota és a ligandumok kötőzsebbe jutását segítő konformációs fluktuáció között. A projekt részeként meghatároztuk a humán I-BABP:glikokólát:glikokenodeoxikólát komplex oldatfázisú NMR szerkezetét (PDB: 2MM3). Ennek összevetése a dinamikus NMR vizsgálatokból nyert adatokkal azt mutatja, hogy az epesavak kötődése konformációs szelekció révén történik a szabad fehérjében jelenlevő egyensúlyi folyamat eltolásával egy nyitottabb fehérjeállapot irányába. NMR relaxációs és hődenaturációs mérések együttes analízisével megmutattuk, hogy a ligandumkötést szabályozó konformációs fluktuáció összefügg egy részleges letekeredési folyamattal. Az NMR mérésekkel összhangban MD szimulációs vizsgálatokkal kimutattunk egy megnövekedett hidrofób felszínnel rendelkező, részlegesen kitekeredett fehérje állapotot, amely a ligandum távollétében aggregációs kockázattal jár.
kutatási eredmények (angolul)
Human ileal bile acid-binding protein (I-BABP) binds and carries bile salts in the epithelial cells of the distal small intestine and has a key role in the enterohepatic circulation of bile salts. The aim of our project was a better understanding of the structural and dynamic determinants of human I-BABP-bile salt interaction focusing primarily on the mechanism of ligand entry. We have shown that internal motions on the ms timescale in human I-BABP have a key role in the binding process. pH-dependent NMR relaxation measurements unveil an intimate relation between histidine protonation and an opening/closing motion mediating ligand entry in the apo form of human I-BABP raising the possibility of a pH-dependent mechanism of bile salt uptake in the enterocytes of the distal small intestine. The solution NMR structure of the ternary complex of human I-BABP with glycocholate and glycochenodeoxycholate (PDB: 2MM3), the two most abundant bile salts in humans, along with the NMR dynamic data suggests a conformational selection mechanism of bile salt binding. A joint analysis of relaxation dispersion NMR measurements and thermal melting data shows a structural and thermodynamic connection between ms timescale conformational fluctuations at and below room temperature and thermal unfolding of the protein. Supporting the NMR data, MD simulations capture a partially unfolded state with an increased hydrophobic surface, posing an aggregation risk for the protein in the absence of ligands.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=109035
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
Merő B, Radnai L, Gógl G, Tőke O, Leveles I, Koprivanacz K, Szeder B, Dülk M, Kudlik G, Vas V, Cserkaszky A, Sipeki S, Nyitrai L, Vértessy BG, Buday L: Structural insights into the tyrosinephosphorylation-mediated inhibitionof SH3 domain-ligand interactions, Journal of Biological Chemistry doi: 10.1074/jbc.RA118.004732, 2019
Horváth G, Egyed O, Fizil Á, Kovács M, Tőke O: The pH dependence of ligand binding in human ileal bile acid-binding protein. Exploring the role of histidine protonation, MTA NMR Munkabizottság Előadóülése, Balatonszemes, 2018. május 24-25., 2018
Horváth G, Biczók L, Kovács M, Majer Z, Micsonai A, Kardos J, Tőke O: Order-disorder transitions mediating ligand entry in an intracellular lipid-binding protein, Gordon Research Conference (Intrinsically Disordered Proteins), Les Diablerets, Svájc, 2018, július 1-6., 2018
Tőke O: Epesav-kötő fehérjék, Buday, L; Nyitrai, L; Perczel, A - Ezerarcú fehérjék, Budapest, Magyarország : Semmelweis Kiadó, (2018) pp. 869-879., 2018
Batta G, Bodor A, Kövér K, Martinek T, Perczel A, Tőke O: NMR- és ESR-spektroszkópia, Buday, L; Nyitrai, L; Perczel, A - Ezerarcú fehérjék Budapest, Magyarország : Semmelweis Kiadó, (2018) pp. 203-256., 2018
Harmat Z, Szabó AL,Tőke O, Gáspári Z: Structural ensembles based on NMR parameters suggest a complex pathway of ligand binding in human gastrotropin, bioRxiv 409383, Cold Spring Harbor Laboratory, 2018
Horváth G, Egyed O, Tang C, Kovács M, Micsonai A, Kardos J, Tőke O: Ligand entry in human ileal bile acid-binding protein is mediated by histidine protonation, Scientific Reports, accepted for publication, 2019
Horváth G, Egyed O, Toke O: Temperature dependence of backbone dynamics in human ileal bile acid-binding protein: implications for the mechanism of ligand binding, Biochemistry, 2014
Maksay G, Tőke O: Asymmetric perturbations of signalling oligomers, Progress in Biophysics and Molecular Biology, 2014
Gergő Horváth, Ákos Bencsura, Ágnes Simon, Gregory P. Tochtrop, Gregory T. DeKoster, Douglas F. Covey, David P. Cistola, Orsolya Tőke: Structural determinants of ligand binding in the ternary complex of human ileal bile acid binding protein with GCA and GCDA obtained from solution NMR, FEBS Journal 283:541-555, 2016
Horváth Gergő: Belső molekuláris mozgások vizsgálata a humán epesav-kötő fehérjében NMR-spektroszkópiával, ELTE TTK Biológia Doktori Iskola, 2015
Horváth Gergő, Fizil Ádám, Kovács Mihály, Tőke Orsolya: A ligandum kötés pH-függésének vizsgálata a humán epesav-kötő fehérjében, MTA Peptidkémiai Munkabizottság Elóadóülése, Balatonszemes 2016. május 30 - június 1., 2016
Horváth Gergő, Bóta Attila, Tőke Orsolya: Thermal denaturation in human ileal bile acid-binding protein, MTA NMR Munkabizottság Előadóülése, Balatonszemes, 2015. április 24-25., 2015
Koprivanacz K, Tőke O, Besztercei B, Juhász T, Radnai L, Merő B, Mihály J, Péter M, Balogh G, Vígh L, Buday L, Liliom K: The SH3 domain of Caskin1 binds to lysophosphatidic acid suggesting a direct role for the lipid in intracellular signaling, Cellular Signalling 32:66-75, 2017
Tőke O, Vonderviszt F: Amphipathic helical ordering of the flagellar secretion signal of Salmonella flagellin, Biochem. Biophys. Res. Comm. 476:641-647, 2016
Horváth G, Egyed O, Toke O: Temperature dependence of backbone dynamics in human ileal bile acid-binding protein: implications for the mechanism of ligand binding, Biochemistry 53:5186-5198, 2014
Maksay G, Tőke O: Asymmetric perturbations of signalling oligomers, Progress in Biophysics and Molecular Biology 114:153-169, 2014
Horváth G, Biczók L, Majer Z, Kovács M, Micsonai A, Kardos J, Tőke O: Structural insight into a partially unfolded state preceding aggregation in an intracellular lipid-binding protein, FEBS Journal 284:3637-3661, 2017
Horváth G, Egyed O, Fizil Á, Kovács M, Tőke O: The pH-dependence of internal motions in human ileal bile acid-binding protein: Implications for the mechanism of ligand binding, MMCE 2017 Conference Abstracts, 2017
Horváth G, Micsonai A, Kardos J, Tőke O: Kooperatív letekeredés a humán epesav-kötő fehérjében, MTA NMR Munkabizottság Előadóülése, Balatonszemes, 2017. október 16-17., 2017
Horváth G, Egyed O, Tőke O: Konformációs egyensúlyok a humán epesav-kötő fehérjében, MTA Peptidkémiai Munkabizottság Előadóülése, Balatonszemes, 2017. május 29-31., 2017
Tőke Orsolya: Izgő-mozgó fehérjék. Dinamika és Funkció, Élet és Tudomány LXXII. évf. 39. szám, 1231-1234. old, 2017
Gergő Horváth, Ákos Bencsura, Ágnes Simon, Gregory P. Tochtrop, Gregory T. DeKoster, Douglas F. Covey, David P. Cistola, Orsolya Tőke: Structural determinants of ligand binding in the ternary complex of human ileal bile acid binding protein with GCA and GCDA obtained from solution NMR, FEBS Journal 283:541-555, 2016




vissza »