Az autofágia mikro-RNS alapú génszabályozási mechanizmusának vizsgálata ecetmuslicában  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
112632
típus PD
Vezető kutató Hegedűs Krisztina
magyar cím Az autofágia mikro-RNS alapú génszabályozási mechanizmusának vizsgálata ecetmuslicában
Angol cím Regulation of autophagy by microRNAs in Drosophila
magyar kulcsszavak autofágia, mikro-RNS, ecetmuslica, génszabályozás, jelátvitel
angol kulcsszavak autophagy, microRNA, Drosophila, gene regulation, signaling
megadott besorolás
Sejtbiológia, molekuláris transzportmechanizmusok (Orvosi és Biológiai Tudományok)80 %
Epigenetika és génszabályozás (Orvosi és Biológiai Tudományok)10 %
Jelátvitel (Orvosi és Biológiai Tudományok)10 %
zsűri Sejt- és Fejlődésbiológia
Kutatóhely Anatómiai, Sejt- és Fejlődésbiológiai Tanszék (Eötvös Loránd Tudományegyetem)
projekt kezdete 2014-10-01
projekt vége 2017-09-30
aktuális összeg (MFt) 23.802
FTE (kutatóév egyenérték) 2.70
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

Az autofágia evolúciósan konzervált, minden eukarióta sejtre jellemző önemésztő folyamat, amely elősegíti a túlélést szélsőséges körülmények között. A folyamat során a sejt saját anyagait irányítja a lizoszómákba, amelyek lebontásra kerülnek és újrahasznosulnak. Drosophila és emlős sejtekben is, az evolúciósan konzervált Atg (autofágia) gének szabályozzák az autofagoszómák képződését. Az ecetmuslica az autofágia kutatások kiváló alanya, mivel zsírtestje alkalmas mind a fejlődés során normálisan lezajló, mind a stressz hatására bekövetkező autofág folyamatok tanulmányozására. Az elmúlt évtized felismerése, hogy a mikro-RNS-ek fehérjét nem kódoló RNS molekulák, amelyek a génexpressziót szabályozzák, és ezáltal a szervezet szinte valamennyi folyamatának regulációjában részt vesznek. Tervem egy olyan vizsgálatsorozat kivitelezése, amelyben 170 túltermeltetett mikro-RNS hatását vizsgálnánk meg egyesével az autofágia regulációjára. A találatok közül kiválasztott három legígéretesebb jelöltet további analízisnek vetjük alá Cas9-mediált génkiütéssel és mutánsmenekítéses vizsgálatokkal. A kiválasztott mutánsokat és overexpresszáló állatokat funkcionális vizsgálatoknak vetjük alá: stressztűrést, élethosszt és a neuromuszkuláris rendszer működését vizsgáljuk majd. A mikro-RNS-ek célgénjeit, amelyek között Atg géneket és az autofágia regulátor útvonalainak (inzulin/TOR jelátvitel) elemeit feltételezzük, bioinformatikai eszközökkel predikáljuk és kísérletesen igazoljuk. Az autofágia szerepe a stressztűrés, rák, öregedés és a neurodegeneratív betegségek esetében is egyértelműen bizonyított, így eredményeink hozzájárulhatnak számos jövőbeli terápiás alkalmazás kifejlesztéséhez.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

A kutatás fő alapkérdése olyan regulátor molekulák felkutatása, amelyek fontos szerepet töltenek be az autofágia szabályozásában. Célunk megvalósításának első lépése egy nagy léptékű, in vivo overexpressziós screen elvégzése 170 mikro-RNS génen, olyan mikro-RNS-eket keresve, amelyek serkentik vagy gátolják az autofágiát. A találatokat az autofág fenotípus, fiziológiás expressziós mintázat és a feltételezett target alapján csoportosítjuk. Következő célkitűzésünk három körültekintően kiválasztott mikro-RNS génre génkiütött mutánsok létrehozása a Cas9 nukleáz segítségével. Ezen mikro-RNS mutánsok autofág fenotípusát standard autofág tesztekkel állapítjuk meg, majd menekítéssel igazoljuk in vivo szerepüket az autofágiában. További vizsgálataink az éhezési- és oxidatív stressztűrő képesség, élethossz, és a neuromuszkuláris rendszer állapotának felmérésére (negatív geotaxis esszével) irányulnak. Harmadik célkitűzésünk annak feltárása, hogyan regulálják ezek a mikro-RNS-ek az autofágiát. Ebben a szakaszban bioinformatikai eszközök felhasználásával keressük a kiválasztott mikro-RNS-ek target génjeit, majd ezt a becslést kísérletesen is megerősítjük a target fehérje és RNS transzkript szintjének meghatározásával. Ehhez a már meglévő transzgénikus Atg riportereinket és ellenanyagainkat tervezzük felhasználni. Szükség szerint új transzgénikus vonalak is létrehozhatók a target génben módosított mikro-RNS felismerőhellyel illetve GFP riporterek a mikro-RNS-ek szabályozó szekvenciáira.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

Az autofágia folyamatának fontos szerepe van a sejtszintű, és az egész szervezetre kiterjedő homeosztázis fenntartásában egyaránt. Feladata a citoplazma-komponensek normális turnoverének biztosítása, a sérült, működésképtelen vagy káros sejtalkotók, akár teljes organellumok lebontása. Az autofágia nem megfelelő működése betegségek sorához vezethet, beleértve például a korai öregedést, rákot, neurodegenerációt, miopátiákat, csökkent immunműködést. Így az autofágia mechanizmusának tisztázása fontos orvosbiológiai jelentőséggel bír és jövőbeli terápiás utakat jelölhet ki. A mikro-RNS-ek igen fontos szabályozó szerepet látnak el majdnem az összes sejten belüli folyamatban, a génexpresszió regulálása révén. A mikro-RNS-ek génjei meghatározott expressziós mintázatot követnek és target gének expresszióját szabályozzák, amelyeknek transzkriptumai komplementer régiót tartalmaznak, általában a nem transzlálódó szakaszon. Ismert, hogy az Atg gének expressziója az autofágia indukciója folyamán szabályozott módon történik. Az ecetmuslica kiváló modellállat mind az autofágia, mind a mikro-RNS-ek tanulmányozásához, mivel a génredundancia sokkal alacsonyabb szintű, mint az emlősöknél, leegyszerűsítve ezzel a funkcionális analízist. Emberben több mint 1500 mikro-RNS ismernek. Ecetmuslicában mindössze 240-et, amely lefedi a fő mikro-RNS családokat és jelentős részük egyértelmű homológiát mutat az emlős mikro-RNS-ekkel. Az általunk tervezett vizsgálat az in vivo ecetmuslicában előforduló mikro-RNS-ek olyan funkcionális analízise lenne, amelynek fókuszában az autofágia pozitív és negatív regulátorai állnak. További vizsgálataink részletes genetikai analízisnek vetik alá ezeket a szabályozó molekulákat. Ezek a vizsgálatok, együttesen a három kiválasztott találat részletes elemzésével, amely magában foglalja a stressztűrő-képesség, élethossz és neurodegeneráció vizsgálatát, teljes állatban történnek, amely jelentős többlet információt szolgáltathat a humán sejttenyészeti rendszerekkel összehasonlítva. Kutatásunk így feltehetőleg hozzájárul majd ahhoz, hogy betekintés nyerjünk az autofágia szabályozó mechanizmusaiba, annak fiziológiai és patológiai jelentőségébe, egy méltán népszerű genetikai modell organizmusban.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média illetve az adófizetők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI számára.

Az autofágia minden magasabbrendű élőlényre jellemző önemésztő folyamat, melynek során a sejt saját anyagait bontja le, és így lehetővé teszi azok újrahasznosítását. Az autofágia rendkívül összetett és fontos szerepet játszik a sejtek megújulásában, folyamatának zavara a szervezet homeosztatikus egyensúlyának felbomlásához és betegségekhez vezethet. Emiatt molekuláris mechanizmusának és genetikai hátterének pontos feltérképezése és megértése igen fontos. A rovarok, köztük az ecetmuslica, az autofágia kutatásának klasszikus modelljei. Fejlődésük során képesek testük nagymértékű átalakítására és újjáépítésére, és az ezzel együtt járó lebontó folyamatok részben autofágia révén valósulnak meg. Egy évtizede született meg a felfedezés, amely szerint a DNS bizonyos részleteiről, amelyek nem kódolnak fehérjéket, kis méretű RNS molekulák íródhatnak át. Ezen molekulák közül a mikro-RNS-ek a szervezet szinte valamennyi folyamatának szabályozásában részt vesznek. Kutatásunk célja, hogy az autofágia szabályozásában szerepet játszó mikro-RNS-ek szerepét tanulmányozzuk, feltárjunk ezen alapvető folyamatokhoz tartozó szabályozó mechanizmusokat. Ehhez kapcsolódóan az adott célgén(ek)et megkeressük, igazoljuk szerepüket az autofágia folyamatában. Az autofágia szerepe számos betegségben (például a rák, idegrendszeri károsodással járó kórképek, fertőzések), valamint az öregedés és a stressztűrőképesség esetében is egyértelműen bizonyított, így várható eredményeink hozzájárulhatnak terápiás alkalmazások kifejlesztéséhez.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

Autophagy acts as an intracellular self-defense pathway to promote survival in adverse conditions. During autophagy, portions of cytoplasm including organelles are degraded and recycled in lysosomes. Evolutionarily conserved Atg (autophagy) genes mediate autophagosome biogenesis in all eukaryotes including Drosophila and mammals. Fruit flies are excellent tools to dissect the genetics and cell biology of autophagy, and it is known that Atg gene expression is tightly regulated during autophagy stimulation. An emerging regulatory mechanism of cellular and developmental processes is based on modulation of gene expression by microRNAs. I propose to carry out a large-scale screen for microRNAs regulating autophagy, by overexpressing 170 microRNAs one by one in mosaic animals. Three of the most interesting hits will be selected for further characterization by a Cas9-mediated gene knockout approach, and genetic rescue experiments as part of the standard, rigorous genetics of Drosophila. Functional analyses of these microRNA mutant and overexpressing animals will include measurements of stress resistance, longevity and neuromuscular function. Finally, we will carry out mechanistic studies by software prediction and experimental verification of target genes of the selected microRNAs, which may include core Atg genes and known autophagy regulating pathways, such as insulin/TOR growth signaling. As the importance of autophagy in stress survival, cancer, aging and neurodegeneration diseases is firmly established, the long-term benefit of our research is potential future therapeutic uses.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

Our main research question is to identify positive and negative regulator molecules of autophagy. To achieve this, the first specific aim is to carry out a large-scale in vivo overexpression screen of 170 microRNA genes, in search of microRNAs inhibiting or enhancing autophagy. Hits will be grouped according to the autophagy phenotype, physiological expression pattern, and potential predicted targets. Our second specific aim is to generate gene knockouts for three carefully selected microRNAs, using the designer nuclease Cas9. We will characterize the autophagy phenotypes of these microRNA mutants based on our standard autophagy assays, and carry out genetic rescue experiments to confirm their in vivo role in autophagy. Further tests will include starvation and oxidative stress resistance, life span and negative geotaxis assays to assess neuromuscular function. Our third specific aim is to reveal the mechanism how these microRNAs regulate autophagy. During this part of our work, we will identify the most likely targets of the three selected microRNAs using software prediction, which we will experimentally verify based on the determination of target transcript and protein levels. For these, we will use our existing collection of transgenic Atg reporters and antibodies. We can also generate additional transgenic lines for microRNA target genes lacking the microRNA recognition site, and GFP reporters containing the microRNA regulatory sequences.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

The role of autophagy, a cellular defense pathway has been established in the maintenance of cellular and organismal homeostasis. The autophagy-mediated turnover of cytoplasmic material including protein aggregates and defective organelles in lysosomes is a fundamental catabolic process. Autophagy impairment leads to a plethora of diseases, including accelerated aging, cancer initiation, neurodegeneration, myopathies, impaired immunity, and so on. Thus, elucidating the mechanisms that regulate autophagy has an important biomedical relevance, and may provide future avenues for treatment. A very important regulatory mechanism which is relevant for almost all intracellular processes is the regulation of gene expression by microRNAs. These genes show distinct expression patterns, and each of them is able to regulate the expression of target genes that produce mRNAs containing complementary sequences, usually in their untranslated regions. It is known that the expression of Atg genes is tightly regulated during autophagy stimulation. Drosophila represents an ideal animal model to study autophagy and microRNAs, as gene redundancy is much lower than in mammals, simplifying functional analyses. There are more than 1500 microRNAs in human. The 240 such genes found in fruit flies include all major microRNA families, and clear homology of a substantial subset of Drosophila and human microRNAs is evident. Our screen can provide a large-scale, functional analysis of most microRNAs in Drosophila in vivo, focusing on the identification of positive and negative regulators of autophagy. Detailed, further experiments will enable the clear-cut genetic analysis of physiological microRNA regulators of this process. These studies, together with a detailed analysis of three hits focusing on stress resistance, life span and neurodegeneration in a complete animal will give our research project a unique advantage compared to experiments carried out in cultured human cells. Thus, our research will likely provide novel insights into the intimate regulation of autophagy and its physiological and pathological importance in a popular genetic model animal.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NKFI in order to inform decision-makers, media, and the taxpayers.

Autophagy is an intracellular self-digestion procedure, which helps recycling of unnecessary and damaged cell constituents. It maintains homeostasis by protein degradation and turnover of unnecessary or damaged cell organelles for renewal. The significance of autophagy defects in various diseases (cancer, neuropathies, heart disease, infections and so on) and ageing has become apparent in recent years. Autophagy is observed in all eukaryotic cells including fungi, plants, nematodes, insects like fruit flies, rodents (laboratory mice and rats), and humans. The fruit fly is an organism well-suited for genetic analysis and is an ideal animal model to study autophagy. Research in the last decade identified the role for a subfamily of non-coding DNA sequences, which were previously considered junk DNA. Today, a family of short, untranslated RNA molecules, such as microRNAs, is known to play very important roles in gene regulation. I propose to investigate the role of microRNA molecules in autophagy, to identify positive and negative regulators of this process. Software prediction followed by experimental characterization of the target genes for selected microRNAs, which may include core factors involved in autophagy, and detailed analysis of our most important microRNA hits focusing on stress resistance, life span and neurodegeneration, will likely give us important novel insights into the regulation of autophagy. As autophagy is involved in numerous pathologies, understanding the pathways that regulate this process might lead to novel clinical applications in the future.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
A mikro-RNS-ek a sejt-és fejlődésbiológiai folyamatok fontos génexpressziós szabályozói. A mikro-RNS-ek funkcióit in vivo Drosophila melanogaster modellállaton vizsgálva a human miR29 onkomiR szupercsalád egy eddig nem tanulmányozott tagját, a miR995-öt jellemeztük. A funkcióvesztéses miR995 mutáns legyek élethossza rövidebb, bélrendszerük mind funkcionálisan mind morfológiailag jelentősen különbözik a kontroll állatokétól, az állatok csökkent védekezőképességét jelzi, hogy bélrendszerükből a patogéneket nehezebben távolítják el. Igazoltuk, hogy a vizsgált mikro-RNS a bélben a Notch jelátvitel finomhangolása révén szabályozza a bélőssejtek működését, osztódását. Sikeresen feltártuk a mikroRNS célpontjaként azonosított neutralized és snail fehérjék szerepét a bélőssejtek működésében. Ezen elméletet az általunk készített in vivo őssejt-specifikusan kifejezett mikroRNS-GFP szenzorok alkalmazásával támasztottuk alá. A miR29 szupercsaládnak újabb eredmények szerint valóban fontos szerepe van a bélőssejtek működésében, tagjait egyes kolorektális daganatok biomarkereként alkalmazzák. Reményeink szerint a miR995-ről gyűjtött ismereteink segíthetnek majd a humán miR29 családba tartozó RNS molekulák által szabályozott folyamatok megértéséhez és adalékkal szolgálhatnak a kolorektális daganatok kialakulásának jobb megértéséhez is.
kutatási eredmények (angolul)
An emerging regulatory mechanism of cellular and developmental processes is based on the modulation of gene expression by microRNAs. During this study on Drosophila melanogaster as a model organism using a knockout approach to learn about microRNA function in a whole animal, we identified dmel-miR-995 as the still uncharacterized member of the human miR-29 oncomiR family. Among others miR-995 knockout mutants have a shortened lifespan and striking differences in the morphology of the dissected gastro-intestinal tract, they do not eliminate ingested pathogenic bacteria like healthy controls highlighting that this miRNA might impact intestinal immunity and defensive pathways. More specifically, we identified that the level of miR-995 in the gut fine tunes Notch signaling activity in intestinal stem cells (ISC) to balance stem cell decision and proliferation. Interestingly, miR995 seems to coregulate neuralized and snail in ISCs, two essential factors for maintaining stem cell behavior. We verified this after utilizing in vivo GFP sensors to measure miRNA expression in ISCs. Elevated level of human miRNAs of the miR-29 superfamily were recently identified as a biomarker for colorectal cancer (CRC). Thus, we believe that our results about miR-995 will help to understand the function and mechanism of miR-29 superfamily in humans to pave the way for developing new strategies of CRC therapies, prevention and diagnoses.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=112632
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
Csizmadia T, Lorincz P, Hegedus K, Szeplaki Sz, Low P and Juhasz G: Molecular mechanisms of developmentally programmed crinophagy in Drosophila, JOURNAL OF CELL BIOLOGY accepted for publication, 2017
Lorincz P, Toth S, Benko P, Lakatos Z, Boda A, Glatz G, Zobel M, Bisi S, Hegedus K, Takats S, Scita G, Juhasz G: Rab2 promotes autophagic and endocytic lysosomal degradation., J CELL BIOL 216: (7) 1937-1947, 2017
Nagy P, Szatmari Zs, Sandor Gy O, Lippai M, Hegedus K and Juhász G: Drosophila Atg16 promotes enteroendocrine cell differentiation via regulation of intestinal Slit/Robo signaling (accepted for publication), DEVELOPMENT, 2017
Hegedus K, Takats S, Boda A, Jipa A, Nagy P, Varga K, Kovacs AL, Juhasz G: The Ccz1-Mon1-Rab7 module and Rab5 control distinct steps of autophagy., MOL BIOL CELL 27: (20) 3132-3142, 2016
Papp D, Kovacs T, Billes V, Varga M, Tarnoci A, Hackler L Jr, Puskas LG, Liliom H, Tarnok K, Schlett K, Borsy A, Padar Z, Kovacs AL, Hegedus K, Juhasz G, Komlos M, Erdos A, Gulyas B, Vellai T: AUTEN-67, an autophagy-enhancing drug candidate with potent antiaging and neuroprotective effects., AUTOPHAGY 12: (2) 273-286, 2016
Varga K, Nagy P, Arsikin Csordás K, Kovács AL, Hegedűs K, Juhász G: Loss of Atg16 delays the alcohol-induced sedation response via regulation of Corazonin neuropeptide production in Drosophila, SCI REP 6: , 2016
Diána Papp, Tibor Kovács, Viktor Billes, Máté Varg, Anna Tarnóci, László Hackler Jr, László G. Puskás, Hanna Liliom, Krisztián Tárnok, Katalin Schlett, Adrienn Borsy, Zsolt Pádár, Attila L. Kovács, Krisztina Hegedűs, Gábor Juhász, Marcell Komlós, Attila Erdős, Balázs Gulyási & Tibor Vellai: AUTEN-67, an autophagy-enhancing drug candidate with potent antiaging and neuroprotective effects, Autophagy, 2015
Hegedus K, Takats S, Boda A, Jipa A, Nagy P, Varga K, Kovacs AL, Juhasz G: The Ccz1-Mon1-Rab7 module and Rab5 control distinct steps of autophagy., MOL BIOL CELL &: in-press, 2016
Lorincz P, Lakatos Z, Varga A, Maruzs T, Simon-Vecsei Z, Darula Z, Benko P, Csordas G, Lippai M, Ando I, Hegedus K, Medzihradszky K, Takats S, Juhasz G: MiniCORVET is a Vps8-containing hemocyte- and nephrocyte-specific early endosomal tether in Drosophila, ELIFE 5: , 2016
Papp D, Kovacs T, Billes V, Varga M, Tarnoci A, Hackler L Jr, Puskas LG, Liliom H, Tarnok K, Schlett K, Borsy A, Padar Z, Kovacs AL, Hegedus K, Juhasz G, Komlos M, Erdos A, Gulyas B, Vellai T: AUTEN-67, an autophagy-enhancing drug candidate with potent antiaging and neuroprotective effects., AUTOPHAGY 12: (2) 273-286, 2016
Varga K, Nagy P, Arsikin Csordás K, Kovács AL, Hegedűs K, Juhász G: Loss of Atg16 delays the alcohol-induced sedation response via regulation of Corazonin neuropeptide production in Drosophila, SCI REP &: (&) in-press, 2016
Hegedus K, Nagy P, Gaspari Z, Juhasz G: The Putative HORMA Domain Protein Atg101 Dimerizes and Is Required for Starvation-Induced and Selective Autophagy in Drosophila, BIOMED RES INT 2014: , 2014
Nagy P, Hegedus K, Pircs K, Varga A, Juhasz G: Different effects of Atg2 and Atg18 mutations on Atg8a and Atg9 trafficking during starvation in Drosophila., FEBS LETT 588: 408-413, 2014
Nagy P, Karpati M, Varga A, Pircs K, Venkei Z, Takats S, Varga K, Erdi B, Hegedus K, Juhasz G: Atg17/FIP200 localizes to perilysosomal Ref(2)P aggregates and promotes autophagy by activation of Atg1 in Drosophila, AUTOPHAGY 10: (3) 453-467, 2014
Szatmari Z, Kis V, Lippai M, Hegedus K, Farago T, Lorincz P, Tanaka T, Juhasz G, Sass M: Rab11 facilitates crosstalk between autophagy and endosomal pathway through regulation of Hook localization., MOL BIOL CELL 25: (4) 522-531, 2014
Takats S, Pircs K, Nagy P, Varga A, Karpati M, Hegedus K, Kramer H, Kovacs AL, Sass M, Juhasz G: Interaction of the HOPS complex with Syntaxin 17 mediates autophagosome clearance in Drosophila, MOL BIOL CELL 25: (8) 1338-1354, 2014




vissza »