A TIMAP-PP1 komplex szabályozó szerepe a PKC és endotelin útvonal csomópontjában  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
116262
típus PD
Vezető kutató Boratkó Anita
magyar cím A TIMAP-PP1 komplex szabályozó szerepe a PKC és endotelin útvonal csomópontjában
Angol cím Regulatory role of TIMAP-PP1 complex at the crossroad of PKC and endothelin signaling
magyar kulcsszavak endotélium, jelátvitel, defoszforiláció, endotelin-1
angol kulcsszavak endothelium, cell signaling, dephosphorylation, endothelin-1
megadott besorolás
Jelátvitel (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)100 %
zsűri Élettan, Kórélettan, Gyógyszertan és Endokrinológia
Kutatóhely ÁOK Orvosi Vegytani Intézet (Debreceni Egyetem)
projekt kezdete 2016-01-01
projekt vége 2018-12-31
aktuális összeg (MFt) 9.000
FTE (kutatóév egyenérték) 2.50
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

A pulmonáris erek tónusának szabályozása egy rendkívül komplex és többtényezős folyamat. Az endotél sejtek által termelt endogén hatóanyagok érrendszerbe történő kibocsájtása képes parakrin módon hatni, valamint a simaizom sejteket is szabályozza. Az endotelin-1 (ET-1) patofiziológiás szerepét számos betegségben felismerték, mint például a pulmonáris hipertónia vagy szisztémás hipertónia. Az ET-1 szintje nagymértékben függ az endotél sejtek felszínén található ECE-1 (endotelin konvertáló enzim-1) aktivitásától, mely PKC foszforiláció hatására fokozódik. Előzetes eredményeink alapján a protein foszfatáz 1 (PP1) regulátor alegységének, a TIMAP (TGF-β inhibited membrane-associated protein) fehérjének a depléciója az endotél sejtek megnövekedett ET-1 termelését eredményezte, továbbá kimutattuk a TIMAP és ECE-1 kölcsönhatását is. Jelen munkánkban ennek a kölcsönhatásnak a fiziológiai szerepét szeretnénk megvizsgálni, mivel feltételezzük, hogy a TIMAP-PP1 komplex defoszforilálhatja a fehérjét. Másrészről, in vitro sikerült kimutatnunk a TIMAP fehérje PKC általi foszforilációját, mely eddig nem volt ismert. A projekt másik célja a PKC foszforilációs helyek azonosítása, valamint a TIMAP PKC foszforilációjának a PP1-re kifejtett hatásának vizsgálata. Szeretnénk továbbá a TIMAP-ECE-1 útvonal szerepét az endotél-simaizom sejtek kapcsolatában is feltárni. Az eredmények hozzájárulhatnak az ET-1 rendszer szabályozásának jobb megértéséhez, valamint az endotél diszfunkcióval járó betegségekben potenciális gyógyszerek tervezéséhez.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

Az endotél diszfunkció egy olyan szisztémás állapot, melyet az endotélium által termelt anyagok egyensúlyának megbomlása jellemez, mint például endotelin-1 (ET-1) és NO. Számos tanulmány számolt be az ET-1 szerepéről fiziológiás folyamatokban, valamint betegségek kialakulásában is. Az ET útvonalban két receptor, valamint egy membrán-asszociált proteáz (ECE-1) játszik fontos szerepet, utóbbi az “érett” ET-1 proteolitikus hasítását katalizálja. Az ECE-1 aktivitása fokozódik a fehérje PKC kináz általi foszforilációjával, azonban a defoszforilációt végző foszfatázt még nem azonosították. Előzetes eredményeink alapján a protein foszfatáz 1 (PP1) regulátor alegységének, a TIMAP (TGF-β inhibited membrane-associated protein) fehérjének a depléciója az endotél sejtek megnövekedett ET-1 termelését eredményezte. Kimutattuk a TIMAP és ECE-1 kölcsönhatását PMA kezelt sejtek lizátumában. Feltételezzük, hogy a TIMAP-PP1 komplex képes defoszforilálni a fehérjét, ezáltal inaktiválni. További előzetes eredmény a TIMAP in vitro PKC általi foszforilációja, mely eddig nem volt ismert. Az alábbi kérdésekre szeretnénk választ kapni a projekt keretein belül: Mely oldalláncok a PKC foszforilációs helyek a TIMAP fehérjén? Hogyan befolyásolja a foszforiláció a PP1 aktivitását és szubsztrát specificitását? A foszforilált ECE-1 a TIMAP-PP1 szubsztrátja-e? Amennyiben igen, úgy a defoszforiláció hogyan hat az ECE-1 inaktivációjára? Van-e ok-okozati összefüggés a TIMAP depletált sejtek magas ET-1 szintje és az ECE-1 defoszforilációja között? Hogyan hat a TIMAP csendesítés által kiváltott ET-1 szintjének megnövekedése a vaszkuláris simaizom sejtek működésére?

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

Az endotélium az erek belső falát borító sejtek egysoros rétege, mely sokféle hatóanyag (pl. endotelin-1, NO) kibocsájtása révén képes szabályozni az erek tónusát, a sejtek adhézióját, a simaizom sejtek proliferációját, illetve az érfal gyulladási folyamatait. Az endotélium működésének zavara számos érrendszeri betegségben megfigyelhető, mint például magas vérnyomás, koszorúér-betegség, krónikus szívelégtelenség vagy preeclampsia során, ennek ellenére a folyamat mögött álló pontos szabályzó mechanizmusokról még mindig keveset tudunk. Az endotelin-1 (ET-1) az eddig ismert leghatásosabb érösszehúzó peptid, mely igen magas expressziós szinttel rendelkezik a tüdőben. Az ET-1 termelése nagymértékben függ az ECE-1 (endotelin konvertáló enzim-1) enzim lokalizációjától és aktivitásától. Számos érrendszeri betegség hátterében az ET rendszer nem megfelelő működése áll.
Jelen munkánkban az ET szabályozási rendszerében az ECE-1 defoszforilációjának szerepét szeretnénk részletesen vizsgálni. Előzetes eredményeink alapján a TIMAP (TGF-β inhibited membrane-associated protein) fehérje a protein foszfatáz 1 enzim ECE-1-hez történő irányításával, szabályozhatja annak aktivitását. Ebben a folyamatban a TIMAP protein kináz C általi foszforilációja szintén fontos lehet, melyről eddig még nem számoltak be.
A szabályozó folyamatok kulcsmolekuláinak felismerése, hasznos információt nyújthatnak új gyógyszer hatóanyagok tervezésében, az olyan betegségekben, mint például a pulmonáris hipertónia, akut tüdőkárosodás és tüdő tumorok esetében. Az ET termelésének befolyásolása az ECE-1 aktivitásának defoszforiláció általi szabályozásával, az ET rendszer egy eddig nem vizsgált területe. A kapott eredmények hozzájárulhatnak az endotelin-asszociált betegségek patofiziológiájának jobb megértéséhez.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média illetve az adófizetők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI számára.

A vaszkuláris endotélium az erek belső falát borító sejtek szorosan kapcsolódó rétege, mely számos funkcióban tölt be szabályozó szerepet, beleértve a véráramlást, a sejtek adhézióját, a simaizom sejtek osztódását és az érfalak gyulladási folyamatait. Az endothelin-1 (ET) az eddig leírt leghatásosabb érösszehúzó, melyet az endotél sejtek termelnek. Normál körülmények között, az endotelin termelése gondosan szabályozott folyamat. Az ET rendszer nem megfelelő működése, az endotél sejtek gátfunkciójának sérülése, számos betegségben figyelhető meg, mint például pulmonáris hipertónia illetve érelmeszesedés. Munkacsoportunk az endotél sejtekben magas expressziós szinttel rendelkező TIMAP (TGF-β inhibited membrane associated protein) fehérjét vizsgálja. Jelen pályázatban a TIMAP szerepét szeretnénk feltárni az endotelin rendszer szabályozásában. A várható eredmények új információval szolgálhatnak az ET-1 termelésével kapcsolatban, valamint hozzájárulhatnak a TIMAP fehérje endotél sejtekben betöltött funkciójának jobb megismeréséhez. A kutatási eredmények új távlatokat nyithatnak az endotél diszfunkcióval járó betegségek lehetséges farmakológiai célpontjainak azonosításában, az eddig fel nem tárt jelátviteli mechanizmusokon keresztül.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

The regulation of vascular tone in the pulmonary circulation is a complex and multifactorial process. Endothelial cells (EC) are able to release a range of vasoactive molecules that can act either paracrine manner or interact with vascular smooth muscle cells. Endothelin-1 (ET-1) besides its normal function, also has a pathophysiological role in several diseases such as pulmonary arterial hypertension or systematic hypertension. The level of circulating ET-1 is crucially depend on the activity of the endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) on the surface of endothelial cells, that can be increased by PKC phosphorylation. Depletion of a protein phosphatase 1 (PP1) target subunit, TIMAP (TGF-β inhibited membrane-associated protein) in EC increased the level of ET-1. Moreover, we showed direct interaction between TIMAP and ECE-1. In the present proposal we aim to study the physiological role of this interaction. We hypothesize that TIMAP-PP1 complex can dephosphorylate ECE-1. On the other hand, PKC phosphorylation of TIMAP is our other novel finding. Identification of the concerned side chain(s) and the effect of phosphorylation on the activity and substrate specificity of PP1 is another goal of this study. We also would like to widen the study of the TIMAP-ECE-1 signaling pathway to endothelial–smooth muscle cell interactions and clarify the importance of phosphorylation/dephosphorylation processes. The expected results may help to understand the regulation of ET-1 signaling and open new perspectives in development of drugs to influence endothelial cell dysfunction diseases related to ET-1.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

Endothelial dysfunction is a systemic pathological state of the endothelium and can be defined as an imbalance between substances produced by the endothelium such as endothelin-1 (ET-1) and NO. Growing number of evidence confirm the involvement of ET-1 in multiple physiologic functions and in many diseases. Endothelin system is constituted by two receptors and a membrane bound metalloprotease (ECE-1), that produce the mature endothelin via proteolytic cleavage. Activity of ECE-1 can be increased by PKC mediated phosphorylation, but the phosphatase mediating the dephosphorylation is not known yet. Our preliminary results showed that depletion of TIMAP (TGF-β inhibited membrane-associated protein), a protein phosphatase 1 (PP1) regulatory subunit, increased the ET-1 level secreted by endothelial cells (EC). We found specific interaction between ECE-1 and TIMAP protein in PMA treated EC. We hypothesize the TIMAP-PP1 can dephosphorylate and therefore inactivate ECE-1. PKC mediated TIMAP phosphorylation was also shown by us, but the side chain(s) and the effect on PP1c activity is still not known. We address the following questions: What is/are the novel PKC phosphorylation site(s) on TIMAP? How PKC phosphorylation of TIMAP affects activity of PP1c and interaction of ECE-1? Is phosphorylated ECE-1 protein a TIMAP-PP1c substrate? If it is, then how the dephosphorylation of ECE-1 affects the inactivation of the protein? Is the unsatisfactory dephosphorylation of ECE-1 the causal relationship between TIMAP depletion and elevated ET-1 level? How TIMAP depletion in EC and the high ET-1 level affects vascular smooth muscle functions?

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

Although endothelium is only a simple monolayer, it is able to respond to physical and chemical signals by production of a wide range of factors, such as endothelin-1 (ET-1) or NO, that regulate vascular tone, cellular adhesion, smooth muscle cell proliferation, and vessel wall inflammation. Even though endothelial dysfunction is associated with most forms of cardiovascular diseases, like hypertension, coronary artery disease, chronic heart failure or preeclampsia, our knowledge is still limited about the precise mechanisms that regulate the endothelial barrier. ET-1 is a potent vasoconstrictor peptide and it is highly expressed in the lung. Production of ET-1 crucially depends on the localization and activity of endothelin converting enzyme-1 (ECE-1). Dysregulation of the ET system is a leading cause in many cardiovascular diseases.
In our present study we would like to investigate the regulation of the ET system, with special emphasis on the regulation of ECE-1 activity via dephosphorylation. Our preliminary results imply that TIMAP (TGF-β inhibited membrane-associated protein) directs protein phosphatase 1 (PP1) to ECE-1. Within this process the protein kinase C mediated phosphorylation of TIMAP seems to be important, that is also a novel finding of us.
Identification of key molecules influencing physiological events, such as dephosphorylation, might also contribute to planning new drugs in the treatment of related diseases, like pulmonary arterial hypertension, acute lung injury and pulmonary tumors. Knowledge about the control of endothelin production by regulating ECE-1 dephosphorylation opens up a new area of endothelin biology and can provide novel insights into the physiology and pathophysiology of endothelin-associated diseases.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NKFI in order to inform decision-makers, media, and the taxpayers.

Vascular endothelium is the layer of closely connected cells lining the inner surface of blood vessels. It regulates a variety of processes including vascular tone, cellular adhesion, smooth muscle cell proliferation, and vessel wall inflammation. Endothelin-1 (ET-1) is an extremely powerful vasoconstrictor secreted by endothelial cells and plays a role in vascular remodelling. Under normal conditions, the effects of the ET-1 are carefully regulated through inhibition or stimulation of ET-1 release from endothelium. Endothelial barrier dysfunction occurs in a variety of diseases related to ET system, such as pulmonary arterial hypertension or atherosclerosis. We are interested in an endothelial cell type specific protein, called TIMAP (TGF-β inhibited membrane associated protein). In the present proposal, we intend to study the involvement of TIMAP in the regulation of ET system. Our expected results may provide further information on the mechanism of ET-1 secretion and may open new perspectives of our knowledge on the physiological function of TIMAP in endothelial cells and explore a yet unidentified signal transduction mechanism. In addition, the information generated in these studies may provide valuable insights into potential targets for the pharmacological regulation of endothelin production and thus vascular tone.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
A protein foszfatáz 1 (PP1) regulátor alegysége, a TIMAP fehérje szerepét vizsgáltuk az endotél sejtek jelátviteli folyamataiban. Kimutattuk, hogy a TIMAP-PP1 szerepet játszik az endotél sejtek endothelin-1 (ET-1) szekréciójában. A TIMAP depletált sejtekben megnőtt az ET-1 termelése, melynek molekuláris hátterében az endothelin konvertáló enzim 1 (ECE-1) foszforilációs szabályozása áll. A PKC által foszforilált ECE-1 a sejtek membránjába transzlokálódik, ahol az ET-1 termelésének utolsó, érési lépését katalizálja. Az ECE-1-et a TIMAP-PP1 defoszforilálja és ezzel inaktiválja. Azonosítottunk egy új, eddig nem vizsgált foszforilációs helyet a TIMAP fehérjében. A Ser331 oldalláncot a PKCα enzim foszforilálja, ezzel a TIMAP-PP1 aktivitása a foszfo-ERM fehérjék irányába csökken és az endotél barrier integritása jelentősen sérül. Új szubsztrát fehérjeként azonosítottuk a merlint (neurofibromin 2), amely a sejtmagban tumor szuppresszorként ismert, míg onnan kikerülve a sejtek proliferációját szabályozza. Eredményeink alapján az endotél sejtekben a Ser518 defoszforilációját a TIMAP-PP1 végzi. A defoszforilált merlin sejtmagi lokaliációjához az EBP50 adaptor fehérje szükséges, mivel depléciójának hatására a merlin transzlokálódik a sejtmagból. Összeségében sikerült azonosítanunk a TIMAP-PP1 komplex két új szubsztrát fehérjéjét, valamint a TIMAP egy új szabályozó foszforilációs helyét. Eredményeink nagyban hozzájárulnak az endotél sejtek jelátviteli útvonalainak megértéséhez.
kutatási eredmények (angolul)
The role of TIMAP, a protein phosphatase 1 (PP1) regulatory subunit was studied in signaling pathways of endothelial cells. We have shown that TIMAP-PP1 plays a role in endothelin-1 (ET-1) secretion of endothelial cells. In TIMAP depleted cells, the production of ET-1 increased due to the phosphorylational regulation of endothelin converting enzyme 1 (ECE-1). PKC phosphorylated ECE-1 translocates to the cell membrane, where it catalyzes the final maturation step of ET-1 production. ECE-1 is dephosphorylated by TIMAP-PP1 and consequently inactivated. We have identified a novel phosphorylation site in TIMAP protein. Ser331 side chain is phosphorylated by PKCα and reduces the activity of TIMAP-PP1 towards phospho-ERM proteins, moreover it disrupts the endothelial barrier integrity. We have identified merlin (neurofibromine 2), as a new substrate protein of TIMAP-PP1. Merlin is known as a tumor suppressor in the nucleus of the cells, while in the membrane it plays a role in the regulation of cell proliferation. According to our results, in endothelial cells the dephosphorylation of Ser518 is catalyzed by TIMAP-PP1. The nuclear localization of the dephosphorylated merlin requires EBP50 adaptor protein, since its depletion causes translocation of merlin from the nucleus. In conclusion, we have identified two new substrate proteins of the TIMAP-PP1 complex and a new phosphorylation site of TIMAP. Our results contribute to understand the signaling pathways of endothelial cells.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=116262
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
Boratkó A,Csortos Cs: TIMAP, the versatile protein phosphatase 1 regulator in endothelial cells, IUBMB LIFE 69: (12) pp. 918-928., 2017
Boratkó A, Csortos Cs.: TIMAP, the versatile protein phosphatase 1 regulator in endothelial cells., IUBMB Life. 2017 Dec;69(12):918-928. doi: 10.1002/iub.1695. Epub 2017 Nov 15., 2017
Nikolett Király, Csilla Csortos, Anita Boratkó: Examination of TIMAP-Ser69 phosphorylation in endothelial cell, Hungarian Molecular Life Sciences, 2017
Király Nikolett, Csortos Csilla, Boratkó Anita: A TIMAP-Ser69 foszforilációjának vizsgálata endotél sejtekben, 47. Membrán-Transzport Konferencia, 2017
Boratkó A, Csortos Cs: PKC mediated phosphorylation of TIMAP regulates PP1c activity and endothelial barrier function, BBA-MOL CELL RES 1864: 431-439, 2017
Boratkó A, Péter M, Csortos Cs: Regulation of merlin by protein phosphataswe 1-TIMAP and EBP50 in endothelial cells, INT J BIOCHEM CELL B 82: 10-17, 2017
Boratkó A, Veréb Z, Petrovski G, Csortos Cs: TIMAP-protein phosphatase 1-complex controls endothelin-1 production via ECE-1 dephosphorylation, International Journal of Biochemistry and Cell Biology 73: 11-18, 2016
Mikó E,Vida A,Kovács T,Ujlaki Gy,Trencsényi Gy,Márton J,Sári Zs,Kovács P,Boratkó A,Hujber Z,Csonka T,Antal-Szalmás P,Watanabe M,Gombos I,Csoka B,Kiss B,Vígh L,Szabó J,Méhes G,Sebestyén A,Goedert JJ,Bai P: Lithocholic acid, a bacterial metabolite reduces breast cancer cell proliferation and aggressiveness, BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-BIOENERGETICS 1859: (9) pp. 958-974., 2018




vissza »