A kukorica genom transzgén-mentes, génspecifikus szerkesztése szintetikus oligonukleotidokkal és azok kombinálása a CRISPR/Cas9 rendszerrel  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
116318
típus K
Vezető kutató Ayaydin Ferhan
magyar cím A kukorica genom transzgén-mentes, génspecifikus szerkesztése szintetikus oligonukleotidokkal és azok kombinálása a CRISPR/Cas9 rendszerrel
Angol cím Transgene-free gene specific editing of maize genome with synthetic oligonucleotides and their combination with CRISPR/Cas9 system
magyar kulcsszavak Szintetikus oligonukleotidok, CRISPR/Cas9, kukorica, génszerkesztés
angol kulcsszavak Synthetic oligonucleotides, CRISPR/Cas9, maize, gene editing
megadott besorolás
Növényi biotechnológia (Komplex Környezettudományi Kollégium)100 %
zsűri Növénytermesztés, állattenyésztés
Kutatóhely Növénybiológiai Intézet (MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont)
résztvevők Dudits Dénes
Ferenc Györgyi
Fodor Elfrieda
Kupihár Zoltán
Sass László
Tiricz Hilda
Zomboriné Nagy Bettina
projekt kezdete 2015-09-01
projekt vége 2018-08-31
aktuális összeg (MFt) 32.538
FTE (kutatóév egyenérték) 8.30
állapot aktív projekt





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
A CRISPR/Cas9 módszer központi figyelmet kap a genomszerkesztési technológiák fejlesztésében, amelyek forradalmasítják a növénytudományokat és -nemesítést. A módszer körüli jogviták miatt, a jelen program az oligonukleotid-alapú irányított nukleotidcsere (OTNE) továbbfejlesztését tűzi ki célként. A génspecifikus mutációk követésére markerekként használjuk a zöld fluoreszencia helyreállítódását a mutáns GFP génben, az 5-metil triptofán (5-MT) rezisztenciát, illetve a klorotikus tüneteket, amelyek a fitoén deszaturáz gén hibájából származnak. A vezér RNS és a Cas9 nukleáz szintézisét biztosító plazmidokat és a szintetikus oligonukleotidokat génpuskával lőjük be rizs és kukorica sejtekbe. Új módszerként kationos polimereket alkalmazunk a protoplasztokba történő DNS bevitelhez. Bemutattuk, hogy a kromatin szerkezet fellazításával növelni lehet az OTNE események gyakoriságát. Ezért mi kidolgoztunk egy újdonság értékű in planta módszert, amikor az oligonukleotidokat a kukorica csíranövények hajtásmerisztéma régiójába injektáljuk, és ezzel klorotikus mutáns szövetrégiókat nyerhetünk kifejlett haploid növények leveleiben. Mind a CRISPR, mind az OTNE módszert használtuk 5-MT rezisztens rizs sejtek előállítására. Túl a CRISPR komponensek plazmidokkal történő kifejeztetésén elindítottuk a rekombináns Cas9 fehérje és vezér RNS-ek in vitro szintézisét a crRNS and tracrRNS molekulák összekapcsolásával a transzgén mentes genomszerkesztési módszer kidolgozása érdekében.
kutatási eredmények (angolul)
CRISPR/Cas9 system is in focus of developing genome editing technologies that can revolutionize plant research and breeding. In the present program, we gave high priority to optimizing methodology of oligo-targeted nucleotide exchange (OTNE) as complementary approach. In monitoring gene specific mutations, we used markers as restoration of green fluorescence function of mutant GFP gene, resistance against 5-methyl tryptophan (5-MT), or chlorotic leaf tissues generated by mutation in maize phytoene desaturase gene. Plasmids expressing gRNA and Cas9 nuclease as well as synthetic oligonucleotides (SDOs) were delivered by biolistic method into cultured maize, rice cells. As novel protocol we used cationic polymers to deliver nucleic acids into protoplasts. We showed that induction of relaxed chromatin can improve OTNE frequency. We established a novel in planta editing protocol based on injection of SDOs into apical meristematic region of haploid maize seedlings. Targeted mutation in the phytoene desaturase gene resulted in chlorotic mutations. For generation of feedback insensitive anthranilate synthase (AS) mutation, both the CRISPR and OTNE (oligo-targeted nucleotide exchange) technologies were tested in rice cells and 5-MT resistant cells were produced for further analysis. In addition to plasmid based delivery of CRISPR components, synthetic guide RNAs were combined with crRNA and tracrRNA segments and recombinant Cas9 protein to insure transgene-free editing.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=116318
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
D. Rakk, B. Bodnár, F. Kincses, G. Ferenc, Á. Nyerges, M. Mészáros, Sz. Veszelka, M. Deli, D. Dudits, L. Kovács, Z. Kupihár: Lipid derivatives of oligonucleotides - Preliminary Results, EuroTIDES conference poster (Berlin, Germany), 2015
F. Ayaydin, E. Kotogány, E. Ábrahám, G.V. Horváth: Detection of Changes in the Medicago sativa Retinoblastoma-Related Protein (MsRBR1) Phosphorylation During Cell Cycle Progression in Synchronized Cell Suspension Culture, “Methods Molecular Biology” Cell Cycle Synchronization, Vol. 1524, Gáspár Bánfalvi (Ed). (IN PRINT)(Relates to grant due to flow cytometry analysis of nuclei), 2016
H. Tiricz, B. Nagy, G. Ferenc, K. Török, I. Nagy, D. Dudits and F. Ayaydin: Relaxed chromatin induced by histone deacetylase inhibitors improves the oligonucleotide-directed gene editing in plant cells., SUBMITTED to BMC Plant Biology, 2016
G. Ferenc and D. Dudits: Génspecifikus mutagenezis rövid szintetikus DNS-molekulákkal, Precíziós nemesítés – Kulcs az agrárinnovációhoz. Eds: Ervin Balázs and Dénes Dudits. Publisher: Agroinform. (Open Access availability is in progress), 2017
H. Tiricz, B. Nagy, G. Ferenc, K. Török, I. Nagy, D. Dudits and F. Ayaydin: Relaxed chromatin induced by histone deacetylase inhibitors improves the oligonucleotide-directed gene editing in plant cells., Journal of Plant Research, 2017
F. Ayaydin, E. Kotogány, E. Ábrahám, G.V. Horváth: Detection of Changes in the Medicago sativa Retinoblastoma-Related Protein (MsRBR1) Phosphorylation During Cell Cycle Progression in Synchronized Cell Suspension Culture, “Methods Molecular Biology” Cell Cycle Synchronization, Ed: Gáspár Bánfalvi. Publisher: Springer, Vol. 1524, 267-285. (Open Access availability is in progress), 2017
E. Fodor and F. Ayaydin: Fluorescent probes and live imaging of plant cells., [Accepted] “Advances in Plant Ecophysiology Techniques” Eds: Manuel Reigosa Roger and Adela Sánchez Moreiras. Publisher: Springer., 2017
G. Ferenc, Z. Váradi, A. Bokros, Z. Kupihár E. Fodor, D. Dudits and F. Ayaydin: Studies on Uptake of Oligonucleotide-Lipid Conjugates, TIDES: Oligonucleotide & Peptide Therapeutics conference poster at San Diego, CA, USA. 30.04.-03.05. 2017., 2017
G. Ferenc, K. Kerner Z. Váradi, A. Bokros, Z. Kupihár E. Fodor, D. Dudits and F. Ayaydin: Studies on Uptake of Oligonucleotide-Lipid Conjugates, Straub Days conference poster at Biological Research Center, HAS, Szeged, Hungary. 24.05.-25.05. 2017., 2017
D. Rakk, B. Bodnár, F. Kincses, G. Ferenc, Á. Nyerges, M. Mészáros, Sz. Veszelka, M. Deli, D. Dudits, L. Kovács, Z. Kupihár: Lipid derivatives of oligonucleotides - Preliminary Results, EuroTIDES conference poster (Berlin, Germany), 2015
G. Ferenc and D. Dudits: Génspecifikus mutagenezis rövid szintetikus DNS-molekulákkal, Precíziós nemesítés – Kulcs az agrárinnovációhoz. Eds: Ervin Balázs and Dénes Dudits. Publisher: Agroinform., 2017
H. Tiricz, B. Nagy, G. Ferenc, K. Török, I. Nagy, D. Dudits and F. Ayaydin: Relaxed chromatin induced by histone deacetylase inhibitors improves the oligonucleotide-directed gene editing in plant cells., Journal of Plant Research, 2017
F. Ayaydin, E. Kotogány, E. Ábrahám, G.V. Horváth: Detection of Changes in the Medicago sativa Retinoblastoma-Related Protein (MsRBR1) Phosphorylation During Cell Cycle Progression in Synchronized Cell Suspension Culture, “Methods Molecular Biology” Cell Cycle Synchronization, Ed: Gáspár Bánfalvi. Publisher: Springer, Vol. 1524, 267-285. (Grant relation: flow cytometry analysis of nuclei), 2017
G. Ferenc, Z. Váradi, A. Bokros, Z. Kupihár E. Fodor, D. Dudits and F. Ayaydin: Studies on Uptake of Oligonucleotide-Lipid Conjugates, TIDES: Oligonucleotide & Peptide Therapeutics conference poster at San Diego, CA, USA, 2017
G. Ferenc, K. Kerner Z. Váradi, A. Bokros, Z. Kupihár E. Fodor, D. Dudits and F. Ayaydin: Studies on Uptake of Oligonucleotide-Lipid Conjugates, Straub Days conference poster at Biological Research Center, HAS, Szeged, Hungary, 2017
Öktem A, Ferenc G, Nagy B, Kalac A, Fodor E, Dudits D, Ayaydin F: Delivery of nucleic acids and gene editing components by using a modified cationic polymer, [Poster] 6th Plant Genomics and Gene Editing Congress: Europe, Rotterdam, Netherlands, 2018
Ferenc G, Kupihár Z, Fodor E, Kukli T, Szamosvölgyi Á, Nagy B, Zombori Z, Öktem A, Nagy I, Dudits D and Ayaydin F: Chemically modified template ssDNAs and gRNAs for increasing the efficiency of plant gene editing, [Poster] 6th Plant Genomics and Gene Editing Congress: Europe, Rotterdam, Netherlands, 2018
Nagy B, Ferenc G, Török K, Nagy I, Dudits D and Ayaydin F: GFP-based transient gene editing marker system to support selection of agronomic traits: A case study of targeting elevated tryptophan content in maize, [Poster] 6th Plant Genomics and Gene Editing Congress: Europe, Rotterdam, Netherlands, 2018
Zombori Z, Török SP, Nagy B, Ferenc G, Török K, Dudits D and Ayaydin F: Comparison of two different genome-editing technologies (OTNE and CRISPR/Cas9) in maize (Zea mays L.) and rice (Oryza sativa L.) cells, [Poster] 6th Plant Genomics and Gene Editing Congress: Europe, Rotterdam, Netherlands, 2018
Ferenc G, Kupihár Z, Kukli T, Szamosvölgyi A, Kóczán L, Nagy B, Öktem A, Dudits D and Ayaydin F: The effect of chemical modifications of oligonucleotides on gene editing efficiency in plant cells, [Poster] Straub-days, Szeged, Hungary, 2018
Kelemen-Valkony I, Ayaydin F: Efficient long term cryopreservation of plant cultures, [Poster] Straub-days, Szeged, Hungary (Relation to this grant: Successful long-term freezing and viable thawing of GFP transgenic maize cultures), 2018
Török SP, Török K, Dudits D, Ayaydin F, Zombori Z: Comparison of different genome-editing technologies (CRISPR/Cas9 and OTNE) in maize (Zea mays L.) and rice (Oryza sativa L.), [Poster] Straub-days, Szeged, Hungary, 2018
Öktem A, Ferenc G, Kalac A, Fodor E, Dudits D, Ayaydin F: Novel polymer-based delivery of gene editing components in plants, [Poster] Straub-days, Szeged, Hungary, 2018
E. Fodor and F. Ayaydin: Fluorescent probes and live imaging of plant cells., “Advances in Plant Ecophysiology Techniques” Eds: Manuel Reigosa Roger and Adela Sánchez Moreiras. Publisher: Springer Nature, pp. 241-251, 2018
Rádi F, Nagy B, Ferenc G, Török K, Nagy I, Zombori Z, Dudits D, Ayaydin F: Targeted mutagenesis in maize somatic cells by injection of synthetic oligonucleotides into the apical meristem region of seedlings, [Submitted to Plant Journal], 2018





 

Projekt eseményei

 
2016-08-29 14:00:44
Résztvevők változása




vissza »