 |
Fotokémiai reakciócentrumok szerkezeti és spektroszkópiai sajátságai különböző molekuláris környezetben
|
súgó 
nyomtatás 
|
Ezen az oldalon az NKFI Elektronikus Pályázatkezelő Rendszerében nyilvánosságra hozott projektjeit tekintheti meg.
vissza »
|
| |
Projekt adatai |
|
|
| azonosító |
121243 |
| típus |
PD |
| Vezető kutató |
Dorogi Márta |
| magyar cím |
Fotokémiai reakciócentrumok szerkezeti és spektroszkópiai sajátságai különböző molekuláris környezetben |
| Angol cím |
Structural and spectroscopic properties of type II photochemical reaction centers in different molecular environment. |
| magyar kulcsszavak |
Fotoszintézis, membránkörnyezet, szerkezetmeghatározás, reakciócentrum, CD spektroszkópia, fluoreszcencia élettartam. |
| angol kulcsszavak |
Photosynthesis, membrane environment, structure determination, reaction centre, CD spectroscopy, life time measurements |
| megadott besorolás |
| Biofizika (pl. transzport-mechanizmusok, bioenergetika, fluoreszcencia) (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma) | 70 % | | Ortelius tudományág: Biofizika | | Szerkezeti biológia (krisztallográfia és elektronmikroszkópia) (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma) | 30 % |
|
| zsűri |
Fizika |
| Kutatóhely |
Növénybiológiai Intézet (HUN-REN Szegedi Biológiai Kutatóközpont) |
| projekt kezdete |
2016-10-01 |
| projekt vége |
2020-05-31 |
| aktuális összeg (MFt) |
10.176 |
| FTE (kutatóév egyenérték) |
1.17 |
| állapot |
lezárult projekt |
magyar összefoglaló A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A projekt alapvető célkitűzése az, hogy új ismereteket szerezzünk különböző fiziko-kémiai / molekuláris környezetben elhelyezkedő II típusú fotokémiai reakciócentrumok (RC-k) szerkezetéről, a bíborbaktréiumok reakciócentrumáról valamint az ezzel rokon, az oxigénfejlődésért felelős második fotokémiai rendszer (PSII) reakciócentrumáról. Mindkét esetben rendelkezésünkre állnak kristályszerkezeti adatok (Deisenhofer and Michel 1989 EMBO J 8: 2149; Suga et al 2015 Nature 517: 99). Joggal tételezzük föl azonban, hogy a natív, tilakoid membránba ágyazott vagy a detergens micellákban szolubilizált, illetve liposzómákba ültetett RC szerkezetek szerkezeti formái eltérnek a kristályos formában található állapotoktól. Nemrégiben LHCII-n (növényi fénybegyűjtő komplex II-n) végeztünk erre irányuló kísérleteket, és bizonyítékot találtunk arra, hogy az LHCII izolálásához használt detergensek jelentősen módosítják ennek a pigment- protein komplexnek a szerkezetét és funkcionális állapotát (Akhtar, Dorogi et al 2015 JBC 290: 4877). II típusú RC-okra ilyen adatok nem állnak rendelkezésünkre. A kérdés tisztázása érdekében szisztematikus összehasonlító vizsgálatokat tervezünk PSII mikrokristályokon és különböző in vitro és in vivo preparátumokon - szerkezetre érzékeny polarizációs spektroszkópiai és funkcionális állapotot jellemző fluoreszcencia élettartam mérések alkalmazásával. Bakteriális RC-k esetén mikrokristályok jelenleg nem állnak rendelkezésünkre. Itt a különböző minták összehasonlítása jelezheti az egymástól eltérő szerkezetek létét. Bakteriális RC-k esetén ugyanakkor, további módszer alkalmazásával, vizsgálni tudjuk a töltésszétválasztással asszociált spektroszkópiai jeleket.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
A projekt alapvető célkitűzése új ismeretek szerezése különböző fiziko-kémiai / molekuláris környezetben elhelyezkedő II típusú fotokémiai reakciócentrumok (RC-k) szerkezetéről: a bíborbaktréiumok, valamint az oxigénfejlődésért felelős második fotokémiai rendszer (PSII) reakciócentrumairól. Mindkét esetben rendelkezésünkre állnak kristályszerkezeti adatok. Ugyanakkor nincsenek informacióink arra vonatkozóan, hogy a vizsgált kristályok, és az azokból nyert strukturális adatok, mennyiben feleltethetők meg a natív szerkezeteknek.
Nemrégiben növényi fénybegyűjtő komplex II-n végezett kísérleteink bizonyították, hogy a membránból történő kivonásához használt detergensek módosítják a komplex szerkezetét és funkcionális állapotát.Ez alátámasztja projektünk létjogosultságát, azért is mivel krisztallográfiai vizsgákatokat nagy optikai sűrűségű kristályokon, míg optikai spektroszkópiát általában detergenssel szolubilizált mintákon végeznek. Ezzel ellentétben, a jelen projektben, CD, ACD és LD-spektroszkópia valamint fluoreszcencia élettartam mérésekkel fogom vizsgálni az ismert szerkezetű PSII mikrokristályokat; majd az adatokat összevetem detergens-kezelt minták és a natív membránokba vagy különböző lipid kompozíciójú liposzómákba ágyazott komplexek adataival.
További célom a bakteriális, valamint a PSII komplex feltételezett természetes strukturális / funkcionális változatainak jellemzése is. Mivel a bakteriális RC-ból nem állnak rendelkezésünkre mikrokristályok, ezért különböző vad típusú és mutáns RC-okon tudunk összehasonlító vizsgálatokat végezni. Szeretnék kidolgozni egy általános módszert pigment-fehérje komplexek strukturális és funkcionális különbségeinek vizsgálatára.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
A PSII szerkezete érzékeny a fiziko-kémiai ill. molekuláris környezeti változásokra. Elsősorban a membránkörnyezet változásai számottevőek, ami nehézkessé teszi a natív formában megtalálható fehérje komplex konformációjának meghatározását, illetve a kísérletek végzése során a detergens-hatás értelmezését, ami a fehérje kinyerése során elkerülhetetlen. Jelenleg nincs más lehetőségünk az in vivo spektroszkópiai adatok értelmezésére, mint a kristályszerkezeti struktúrából való kiindulás, ami azonban bizonytalan alapokon nyugszik. Ezért projektünk új perspektívát adhat a membrán fehérjekomplexek kutatásában, hiszen célunk, hogy meghatározzuk az in vitro és in vivo rendszerek közötti átmeneti struktúrák konformációit, és olyan kísérleti körülményeket dolgozzunk ki a feltételezett (ill. az LHCII-re bebizonyított) szerkezeti módosulások azonosítására, amelyek alkalmazhatók más pigment-protein komplexek esetére is.
Mikrokristályokon mind az X-FEL mind pedig az optikai spektroszkópia alkalmazható. Krisztallográfiai módszerekkel nem vizsgálható preparátumokat (detergens-szolubilizált komplexek, proteoliposzóma, natív membránok) spektroszkópiai módszerekkel (CD és LD mellett a fotoszintézis kutatásban általunk adaptált ACD), valamint a funkcionális állapotot jellemző fluoreszcencia élettartam segítségével hasonlíthatjuk össze. Ezeknek a vizsgálatoknak az elvégzéséhez csoportunkban rendelkezésre állnak a mérőberendezések. A bakteriális RC-k esetében mikrokristályok nem állnak rendelkezésünkre, viszont különböző molekuláris környezetben vizsgálhatjuk preparátumainkat, és további módszer alkalmazásával vizsgálhatjuk a fehérjén belüli töltésszétválasztás spektroszkópiában is fellelhető jeleit. (Ennek kísérleti feltételeit az elmúlt hónapokban megteremtettük, az SZTE munkatársaival együttműködve proteoliposzómákon CD, ACD és LD méréseket végeztem vad típusú és mutáns bakteriális reakciócentrumok fény-indukált töltésszétválasztásához tartozó változások meghatározására.) Kísérleteinkből fontos információt várunk, mely – áthidalhatja a krisztallográfiai és in vivo szerkezetek és funkcionális állapotok között meglévő (vagy feltételezhető) árkot.
Tudomásunk szerint hasonló kísérletek más laboratóriumokban nem folynak.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
A második fotokémiai rendszernek (PSII) kiemelkedő szerepe van a fotoszintézis folyamatában, hiszen egyedül ez a szuperkomplex képes a víz bontására, és így a légköri oxigén termelésére. Ennek a struktúrának az ismerete ezért és a fotoszintetikus elektrontranszport folyamatokban és regulációs mechanizmusokban betöltött szerepe miatt kulcsfontosságú a fotoszintézis kutatásában. Projektünk alapvető célkitűzése az, hogy – a legmodernebb szerkezetbiológiai berendezésekkel és ’hagyományos’ és innovatív spektroszkópiai módszerekkel az eddigieknél lényegesen részletesebb és megbízhatóbb ismereteket szerezzünk a PSII szerkezetéről és funkcióiról – figyelembe véve, hogy a PSII kifejezetten érzékeny a környezetében történő változásokra: mind in vitro különböző mintákban különböző fiziko-kémiai környezetnek kitéve, mind pedig in vivo a natív membrán különböző funkcionális állapotaiban. A PSII mellett vizsgálatainkat kiterjesztjük a PSII reakciócentrum ’ősének’ tekinthető bakteriális reakciócentrumra is, amelynek szerkezeti meghatározásáért három német tudós 1988-ban Nobel díjat kapott és amelynek szerkezetéről és funkciójáról rendkívül részletes információ-halmaz áll rendelkezésünkre – mindazonáltal az in vivo és in vitro állapotok feltételezhető eltéréseiről nincsenek adataink.
| angol összefoglaló Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
The main objective of the present project is to obtain information about different structural and functional states of type II photochemical reaction centers (RCs), the purple bacterial RC and photosystem II (PSII). Crystal structural data are available for both RCs (Deisenhofer and Michel 1989 EMBO J 8: 2149; Suga et al 2015 Nature 517: 99). However, we do not know to what extent different in vitro and in vivo structures (which are amenable for spectroscopy and functional studies: detergent-solubilized micelles, proteoliposomes with various compositions and RCs in the native membranes) deviate from the crystalline structures. Recently we have demonstrated that detergents used for the extraction from the thylakoid membrane significantly alter the structure and functional state of LHCII, the main light harvesting complex of PSII in plants (Akhtar, Dorogi et al 2015 JBC 290: 4877). At present no such comparative studies are available on the bacterial RC and PSII. Systematic spectroscopic studies are needed to clarify the correlations and differences between the crystallographic data and the native and in vitro forms – structure-sensitive spectroscopic methods and fluorescence lifetime measurements can provide information about the state of RCs. In the case of bacterial RC, microcrystals are currently not available, therefore in this case the comparison of the different samples will be used to indicate structural differences. We can also investigate the charge separation associated spectroscopy signals.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
The main objective of the project is to obtain information about putative structural variations of type II photochemical reaction centers (RCs), the purple bacterial RC and photosystem II (PSII), embedded in various physico-chemical / molecular environments. Crystalography data are available for both RCs. However, it is unclear to what extent they correspond to different in vivo and in vitro states. Recently we have shown that detergents used for extraction from the thylakoid membrane significantly alter the structure and functional state of LHCII, the main light harvesting complex of PSII of green plants, and the in vivo state is best mimicked in proteoliposomes. This corroborates the raison d’etre of our investigation; also because crystallography and optical spectroscopy are normally performed on large optically dense crystals and detergent-solubilized samples, respectively. To clarify the structural variations, I will perform systematic spectroscopic studies, using CD, ACD and LD spectroscopy and fluorescence lifetime measurements, on PSII core microcrystals with known high-resolution structure, and detergent-solubilized samples of the same complexes, and embedded in the native membranes or liposomes with different lipid compositions. A further aim is to identify and characterize the putative natural structural / functional variations of bacterial RCs and PSII core complex preparations in vivo. For bacterial RCs, in the absence of microcrystals, the comparisons will be made between different wild type and mutant RCs. I want to develop an experimental procedure that can be used also for testing structural-functional differences on different pigment-protein complexes.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
The structure of PSII is sensitive to the physico-chemical and molecular environmental changes. The chanching membrane environment can have a high impact on the structure of the embeded protein complexes, making it difficult to determine the conformation of the native forms or to interpret the effect of the detergent used for protein extraction. Currently there is no other opportunity than to use the data of crystal structure to interpret the in vivo spectroscopic information. Therefore our project could give new perspectives for the research of membrane protein complexes, because our objective is to determine the transitional structures between the in vitro and in vivo forms. I would like to develop methods for the identification of structural modifications that can be applied also for other pigment-protein complexes.
Optical spectroscopy and X-ray free electron laser could be used on microcrystals. Structure-sensitive spectroscopic methods (and which were developed for photosynthetic studies in our laboratory – CD, ACD, and LD) as well as steady-state measurements giving information about the functional state of RCs can be applied on native, detergent-solubilized or membrane-inserted RCs that cannot be studied by crystallographic techniques. The equipments for such investigations are availabe in our laboratory.
In the case of bacterial RC microcrystals are currently not available, therefore in this case we can study and compare the structural differences of the RC in different environmental conditions. The charge separation associated CD and ACD signals of bacterial RCs can help to explore the potential alterations induced by the various physico-chemical environments. (In the last months, in colaboration with the University of Szeged we developed the experimental condition for such investigation, I performed CD, ACD and LCD measurements in wild-type and mutant bacterial RCs embedded in lipid membranes to determine the alterations related to charge separation).
We expect that with our investigations we can give information that can bridge the gap between the crystallographic and in vivo systems or functional forms.
To my knowledge similar experiments are not going on in other laboratories.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Photosystem II (PSII) has a prominent role in photosynthetic processes, since this is the only complex capable of splitting water and in this way producing oxygen for the atmosphere. Detailed knowledge of the PSII structure is key to understanding the water oxidation, charge separation and electron transport processes and regulating mechanisms. The main objective of my project is to get more detailed and reliable knowledge about the structure and function of PSII by using modern structural biology approaches and also 'traditional' and innovative spectroscopic methods, taking into account that PSII is very sensitive to environment changes: also in the case of isolated complexes exposed to various physico-chemical environments as well as the membrane-embedded native form in its different functional stages. In addition I will investigate the bacterial photosynthetic reaction center (RC) that is the 'ancestor' of PSII reaction center. Three German scientists recieved Nobel Prize in 1988 for the determination of the bacterial RC structure. We have extensive knowledge about the structure and function of bacterial RC; however, there is no information about the presumed differences between the in vivo and in vitro states.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
