 |
Az alternatív makrofágpolarizáció transzkripciós faktor kaszkádjainak genomszintű vizsgálata újgenerációs szekvenálási eljárások integrációjával
|
súgó 
nyomtatás 
|
Ezen az oldalon az NKFI Elektronikus Pályázatkezelő Rendszerében nyilvánosságra hozott projektjeit tekintheti meg.
vissza »
|
| |
Projekt adatai |
|
|
| azonosító |
124843 |
| típus |
PD |
| Vezető kutató |
Nagy Gergely |
| magyar cím |
Az alternatív makrofágpolarizáció transzkripciós faktor kaszkádjainak genomszintű vizsgálata újgenerációs szekvenálási eljárások integrációjával |
| Angol cím |
Highly integrated genome level examination of transcription factor cascades during alternative macrophage polarization using next-generation sequencing methods |
| magyar kulcsszavak |
makrofágpolarizáció, transzkripciós faktor kaszkád, funkcionális genomika |
| angol kulcsszavak |
macrophage polarization, transcription factor cascade, functional genomics |
| megadott besorolás |
| Bioinformatika (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma) | 80 % | | Epigenetika és génszabályozás (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma) | 10 % | | Molekuláris biológia (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma) | 10 % | | Ortelius tudományág: Molekuláris biológia |
|
| zsűri |
Sejt- és Fejlődésbiológia |
| Kutatóhely |
ÁOK Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet (Debreceni Egyetem) |
| résztvevők |
Nagy László
|
| projekt kezdete |
2017-12-01 |
| projekt vége |
2020-11-30 |
| aktuális összeg (MFt) |
15.219 |
| FTE (kutatóév egyenérték) |
2.40 |
| állapot |
lezárult projekt |
magyar összefoglaló A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
Kutatócsoportunk különböző makrofágok génszabályozását vizsgálja újgenerációs szekvenálási (NGS) eljárások, mint ATAC-seq, ChIP-seq, GRO-seq és RNA-seq alkalmazásával. A ChIP-seq (és közvetve az ATAC-seq is) lehetővé teszi a kromatin fehérjék, pl. a transzkripciós faktorok (TF-ok) DNS-kötésének teljes genom-szintű megfigyelését; a gének átírását vizsgáló NGS (GRO-seq és RNA-seq) módszerek felhasználásával pedig az is meghatározható, hogy az egyes kötőhelyek melyik géneket szabályozzák. Korábban megmutattuk, hogy az RXR hogyan járul hozzá az egér csontvelő eredetű makrofágok génszabályozásához. A jelen projektben az IL-4 kezelt, alternatívan polarizált makrofágok kialakulását és az RXR ebben betöltött szerepét szeretnénk megvizsgálni. Célunk annak a kiderítése, hogy a STAT6-ot követően melyik TF-ok járulnak hozzá ehhez a differenciációhoz. Ismert például, hogy az EGR2 részt vesz az alternatív polarizációban, és legújabb eredményeink szerint a PPARg:RXR heterodimer is szerepet játszik a folyamatban. Az egérből származó adatok mellett rendelkezésünkre állnak IL-4 kezelt humán monocita eredetű makrofágokból származó NGS adatok is. A humán és egér adatok együttes használata páratlan lehetőséget nyújt a génszabályozás fajok közötti összehasonlítására és az evolúciós megőrzöttség meghatározására. Az in vitro modellek mellett szeretnénk kiterjeszteni a tanulmányt az in vivo vázizom „javító” makrofágokra is. Úgy gondoljuk, hogy az alternatív polarizációt és az izomgyógyulást szabályozó TF-ok és cisztrómjaik kölcsönhatásainak és dinamikájának megértése általános érvényű szabályszerűségeket nyújthat a nagy ütemben fejlődő funkcionális genomika kutatóinak számára.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
A makrofágokat meghatározó fő TF-ok a PU.1, IRF8, C/EBP és az AP-1, de ezek mellett a szöveti környezettől függően további TF-ok is jelentős szereppel bírhatnak a génszabályozásban. Bizonyos stimulusok (pl. IL-4 vagy izomsérülés) hatására a makrofágok differenciáción mennek keresztül. Az átfogó hipotézisünk az, hogy ezeket a változásokat TF kaszkádok okozzák, amelyek a korábbi cisztrómokra épülve, azokkal együttműködve és azokat kiterjesztve, új szabályozó hálózatokat alakítanak ki, amelyek végül átprogramozzák a sejtet. IL-4 jelenlétének hatására a STAT6 DNS-kötése új TF-ok kifejeződését segíti elő, amelyek ismét más TF-okat serkenthetnek. Ebben a folyamatban vesz részt az EGR2 és a PPARg is, de pontos szerepük nem ismert. Célunk e TF-ok az alternatív polarizációban betöltött szerepének vizsgálata, vad típusú, Egr2 és Pparg KO sejtekből származó NGS adatok alapján; és arra is választ szeretnénk kapni, hogy a PPARg vajon ligandfüggő módon működik-e. A folyamat feltételezhetően humán makrofágokban is hasonlóan zajlik le, amit ugyancsak bizonyítani szeretnénk. Adataink tehát a humán és egér cisztrómok összehasonlítását is lehetővé teszik, amely az érintett gének szabályozásának evolúciójáról is árulkodhat. Korábban leírtuk, hogy a PPARg az izomregenerációban résztvevő makrofágok szabályozásában is szerepet játszik. A legújabb ATAC-seq adataink lehetővé teszik a regeneráció során izolált makrofágok összes szabályozó régiójának feltérképezését. Ezzel az adathalmazzal képesek leszünk a nyitódó és záródó kromatinrégiók meghatározására, melyek DNS elemei felfedik az ezeken működő, tehát végsősoron a változásokért felelős TF-okat.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
Az alternatívan polarizált vagy gyulladásgátló makrofágok az endocitikus funkción felül számos szabályozó szereppel bírnak: részt vesznek az immunszabályozásban, a szövetátépítésben és az érképzésben, amelyek akár tumorképződéshez is vezethetnek. A különböző szövetekben való viszonylag kis sűrűségük ellenére sérülést vagy fertőzést követően ezek a funkciók kulcsszereplőkké teszik a makrofágokat. Hogy megértük a szerepüket, humán és egér in vitro modelleket alkalmazunk, és van egy egér in vivo izomregenerációs modellünk is. A genomi hatásmechanizmusok vizsgálatára a génszabályozó folyamatokat felfedő NGS módszereket alkalmaztunk. Az ATAC-seq az egyik legújabb NGS módszer, amely megmutatja a nem hisztonfehérjék, hanem TF-ok és koregulátoraik által kötött genomi régiókat. A referencia annotációt és a CTCF elemeket felhasználva elkülöníthetjük a promóterközeli és attól távoli szabályozó régiókat, valamint az inzulátorokat, amely lehetővé teszi az adott sejtpopuláció génszabályozásához hozzájáruló legfőbb TF-ok megjóslását. Ez a módszer kevésbé elfogult, mint a ChIP-seq, amely egy kiválasztott fehérje genomi eloszlására összpontosít, de hasonlóan erős motívumfeldúsulásokat ad. Ezek a feldúsulások kijelölik a TF családokat és néha az adott TF-t is, amely(ek) kötheti(k) a motívumokat. Az ATAC-seq akár egy sejten is alkalmazható, így alkalmas olyan kis sejtpopulációk feldolgozására, mint amilyenek egér izomból is kinyerhetőek. Magyarországon mi használtuk először ezt a módszert, de világszerte is csak ~50 olyan labor van, amely képes volt cikket közölni ATAC-seq adatok alapján, és csak ~150 olyan projekt van, amelynek mintáit közzétették az SRA adatbázisban. Fontos megjegyezni azonban, hogy ezek több mint 6000 mintát foglalnak magukban, jelezve a terület erőteljes fejlődését. Mi használunk először kromatinhozzáférhetőségi adatokat makrofágok differenciációs szignálokra adott cisztrómikus válaszainak a követésére. Jövőbeli eredményeink betekintést nyújthatnak az alternatív polarizáció molekuláris mechanizmusába és rámutathatnak a kulcs TF-okra, amelyek meghatározzák a folyamatot. Ezek az eredmények terápiás célpontokat biztosítva segíthetnek számos betegség, pl. fertőzések és tumorok gyógyításában.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
Kutatócsoportunk a makrofágokat, az egyik leginkább központi immunsejteket vizsgálja. Attól függően, hogy melyik szervben vagy szövetben találhatóak, a makrofágok nagyon változatosak. Fő szerepük a haldokló sejtek, a szöveti törmelékek és a kórokozók eltakarítása, de részt vesznek a szövetek kijavításában és a akár daganatok kialakulásában is. Kutatócsoportunk a humán és egér makrofágok génszabályozását vizsgálja. Ehhez az egyik legújabb molekuláris biológiai technikát, az újgenerációs szekvenálást (NGS-t) használjuk. Az NGS-t használó módszerek egy része lehetővé teszi a különböző fehérjék DNS-kötésének megfigyelését, míg más NGS módszerek használatával az is meghatározható, hogy ezek által melyik gének szabályozottak. Ebben a projektben a javító típusú makrofágok fejlődését szeretnénk megvizsgálni. Célunk, hogy megtaláljuk, melyik fehérjék, és hogyan járulnak hozzá ehhez a folyamathoz. Korábban azt találtuk, hogy a PPARg szabályozza mind a humán, mind az egér javító makrofágokat, de a hatásmechanizmus nem ismert pontosan. A PPARg egy zsírsavérzékelő fehérje, amely képes a DNS-hez kötődni, és így szabályozza a géneket, de az nem világos, hogy a rá specifikus jelmolekulák hiányában is képes-e DNS-t kötni. A humán és egér adatok együttes használata páratlan lehetőséget nyújt a különböző fehérjék általi génszabályozás fajok közötti összehasonlítására. Úgy gondoljuk, hogy e fehérjék dinamikusan változó kölcsönhatásainak a megértése általános érvényű szabályszerűségeket nyújthat a kutatóknak, majd később az orvosoknak, hogy hatékonyabban kezelhessék az olyan betegségeket, amelyekben makrofágok is részt vesznek.
| angol összefoglaló Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
Our research group has been examining the gene regulation of different macrophages by applying next-generation sequencing (NGS) methods such as ATAC-seq, ChIP-seq, GRO-seq and RNA-seq. ChIP-seq (and indirectly also ATAC-seq) allow(s) the whole genome-level observation of the DNA-binding of chromatin proteins e.g. transcription factors (TFs); and with the use of NGS methods examining gene transcription (GRO-seq and RNA-seq) it can also be determined which genes are regulated by the individual binding sites. Previously we have shown how RXR contributes to the gene regulation of mouse bone marrow-derived macrophages. In this project we would like to examine the development of IL-4 treated, alternatively polarized macrophages and the role of RXR in this process. Our goal is to find out that following STAT6, which TFs contribute to this differentiation. It is known that EGR2 participates in alternative polarization, and according to our newest results the PPARg:RXR heterodimer also plays a role in this process. Beside the mouse-derived data we have NGS data from IL-4-treated human monocyte-derived macrophages too. The combined use of human and mouse data provides a unique opportunity for the interspecies comparison of gene regulation to determine evolutionary conservation. Beside the in vitro models we are proposing to extend our studies to in vivo skeletal muscle repair macrophages. We think that the understanding of the interactions and dynamics of TFs and their cistromes regulating alternative polarization and muscle healing might provide general regularities for the researchers of the rapidly developing functional genomics.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
The major TFs determining macrophages are PU.1, IRF8, C/EBP and AP-1, but beside these, depending on the tissue environment, further TFs might play significant roles in gene regulation. As a consequence of certain stimuli (e.g. the presence of IL-4 or muscle damage) macrophages go through a differentiation. Our overarching hypothesis is that these changes are caused by TF cascades, which, building on the pre-established cistromes, working together with and expanding those, form new regulatory networks, which ultimately reprogram the cell. As a result of IL-4 exposure, the DNA-binding of STAT6 induces the expression of new TFs, which might also induce further TFs. EGR2 and PPARg participate in this process, but their exact role is unknown. Our goal is to examine their role in alternative macrophage polarization based on NGS data derived from wild type, Egr2, Rxr and Pparg KO cells; and we would like to get an answer whether PPARg acts in a ligand-dependent manner. Presumably this process takes place similarly in human macrophages, which we also want to prove. Our data thus make possible the comparison of human and mouse cistromes, which may reveal the evolutionary conservation of the involved genes’ regulation. Previously we described that PPARg plays a role in the regulation of macrophages participating in muscle regeneration. Our newest ATAC-seq data make possible to map all the regulatory regions of the macrophages isolated during the regeneration. By this data set we will be able to locate the opening and closing chromatin regions, of which DNA elements reveal those TFs acting through these sites and thus are ultimately responsible for the changes.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
Alternatively polarized or anti-inflammatory macrophages have several regulatory roles beyond their endocytic functions: they participate in immunoregulation, tissue remodeling and angiogenesis, which might even lead to tumor promotion. Despite their relatively low density in the different tissues, these functions make macrophages central players upon injury or infection. To understand their role we apply in vitro models from human and mouse, and we also have an in vivo muscle regeneration model from mice. To investigate the mode of genomic actions we applied NGS methods uncovering gene regulatory processes. ATAC-seq is one of the newest NGS methods showing those genomic regions, which are not covered by histone proteins but instead TFs and their co-regulators. Using the reference annotation and the CTCF elements, we can distinguish the promoter-proximal and promoter-distal regulatory regions, as well as the insulators, which let us predict the major TFs contributing to gene regulation in the given cell population. This method is less biased than a ChIP-seq, which concentrates on the genomic distribution of one chosen protein, but gives similarly strong motif enrichments. These motif enrichments are good indicators of the TF families and sometimes the given TF that is/are able to bind the motifs. ATAC-seq can be applied even on single-cells, thus it is suitable for the processing of as small cell populations as those sorted from mouse muscles. In Hungary we first introduced this method but there are only ~50 laboratories worldwide, which were able to publish articles based on ATAC-seq data, and there are still only ~150 projects of which samples are published in the SRA database. Although it is important to note that these include more than 6000 samples representing the dynamic development of the field. We first use chromatin accessibility data to follow the cistromic responses of macrophages to differentiation signals. Our future results will give insight the molecular mechanism of alternative polarization and will appoint to the key TFs determining the process. These results by providing therapeutic targets might help to cure several pathological processes, such as infections or tumor progression.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Our research group examines macrophages, one of the most central immune cells. Macrophages are very varied depending on the organ or tissue in which they can be found. Their main role is the clearance of dying cells, tissue debris and pathogens, but they participate also in tissue reparation or even tumor progression. Our research group examines the gene regulation of human and mouse macrophages. For this we use one of the newest molecular biology techniques called next-generation sequencing (NGS). Some of the methods using NGS allow the observation of the DNA-binding of different proteins, while with the use of other NGS methods it can also be determined which genes are regulated by these. In this project we would like to examine the development of repair type macrophages. Our goal is to find which proteins and how they contribute to this process. We found previously that both human and mouse repair macrophages are regulated by PPARg, but the mode of action is not well understood. PPARg is a fatty acid sensor, which is able to bind to DNA and thus regulate genes, but it is not clear whether it is able to bind to DNA in the lack of its specific signal molecules. The combined use of human and mouse data provides a unique opportunity for the interspecies comparison of gene regulation by the different proteins. We think that the understanding of the dynamically changing interactions of these proteins might provide general regularities for the researchers and later for the physicians to treat more efficiently those diseases, which macrophages are also involved in.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
