Az Arabidopsis CRK5 protein kináz szerepe az auxin jelátvitel és gravitropizmus szabályozásában  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
128055
típus PD
Vezető kutató Rigó Gábor
magyar cím Az Arabidopsis CRK5 protein kináz szerepe az auxin jelátvitel és gravitropizmus szabályozásában
Angol cím Function of CRK5 in regulation of auxin signaling and gravitropic responses in Arabidopsis
magyar kulcsszavak Arabidopsis thaliana, CRK5, auxin, gyökérfejlődés, szárfejlődés, gravitropikus válasz, foszforiláció,
angol kulcsszavak Arabidopsis thaliana, CRK5, auxin, root development, shoot development, gravitropic response, phosphorylation,
megadott besorolás
Növényi biotechnológia (Komplex Környezettudományi Kollégium)60 %
Molekuláris Biológia (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)20 %
Ortelius tudományág: Molekuláris biológia
Sejtbiológia, molekuláris transzportmechanizmusok (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)20 %
zsűri Élettudományi Zsűrielnökök
Kutatóhely Növénybiológiai Tanszék (Szegedi Tudományegyetem)
projekt kezdete 2017-10-01
projekt vége 2019-02-28
aktuális összeg (MFt) 7.740
FTE (kutatóév egyenérték) 1.20
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

A Föld nehézségi erejét érzékelve a magasabbrendű növények hajtása és gyökere ellentétes irányban növekszik, amit a gravitáció iránya illetve az auxin hormon aszimmetrikus eloszlása szabályoz. Korábbi kutatásainkból tudjuk, hogy a crk5-1 mutáns gyökér gravitropikus válasza késik, a gyökér rövidebb és több elágazást tartalmaz. Ennek oka a megváltozott auxin eloszlás, mely a CRK5 által foszforilált PIN2 auxin efflux fehérje nem megfelelő elhelyezkedéséhez köthető. A tervezett kutatás a CRK5 általi foszforiláció geotropizmusban és gyökérfejlődésben betöltött szerepének megismerését célozza. A projekt során azonosítjuk és jellemezzük a CRK5 által foszforilált illetve vele kölcsönható fehérjéket. Tudjuk, hogy a PIN2 (és valószínűleg a PIN3) transzporter a CRK5 foszforilációs célpontja. A foszforiláció jellemzése érdekében proteomikai módszerekkel kívánom meghatározni a PIN transzporterek illetve a projekt keretében azonosított más célfehérjék foszforilált aminosav oldalláncait. A módosítások tanulmányozásához olyan pont mutációkat állítok elő, amelyek meggátolják vagy imitálják a foszforilációt. A mutáns fehérjék transzgenikus növényekben történő kifejeztetésével kaphatok információt a CRK5 által közvetített fehérje módosítások biológiai jelentőségéről. A CRK5 fehérje lehetséges kölcsönható partnereit biokémiai/proteomikai módszerekkel, specifikus immunprecipitációt (pull-down) követő tömegspektroszkópiás analízissel szeretném azonosítani. A fehérje kölcsönhatásokat bimolekuláris fluoreszcencia komplementációval (BiFC) fogom növényi sejtekben jellemezni. A kutatás eredményei várhatóan hozzájárulnak a CRK5 által ellenőrzött jelátviteli folyamatok jobb megértéséhez.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

A magasabbrendű növényekben a hajtások negatív és a gyökerek pozitív gravitopikus válaszait elsősorban az auxin hormon aszimmetrikus eloszlása szabályozza. A korábbi kísérleteink során azonosított CRK5 protein kináz fontos a gravitropizmus létrejöttéért, hiányában a növények nem képesek a gravitációs irány megváltozására reagálni. Pályázatom célja a CRK5 kináz által közvetített fehérje foszforilációnak az egyedfejlődésben illetve a környezeti hatásokra adott élettani válaszok szabályozásában betöltött szerepének pontosabb felderítése. Az alap kérdés eldöntése érdekében egyrészt szeretném azonosítani a CRK5 kináz foszforilációs aktivitásának célpontjait, azokat a fehérjéket, amelyeket ez a kináz foszforilál. Másrészt megpróbálom találni azokat a fehérjéket amelyek a kinázzal kölcsönhatnak. A CRK5 által foszforilált fehérjék jellemzése során szeretném meghatározni a cél fehérjéken azokat az aminosav oldalláncokat, amelyeket a foszforiláció érinthet. Végül de nem utolsó sorban, irányított mutagenezis segítségével szeretnék információt kapni a foszforiláció biológiai szerepéről. A kölcsönható fehérje partnerek illetve a foszforiláció célpontjainak azonosítása, jellemzése révén remélem hogy pontosabb információt kapunk a geotropizmus szabályozásáról, a CRK5 kináz szerepéről az auxin által ellenőrzött fejlődési folyamatok illetve a környezeti hatások által kiváltott válaszreakciók szabályozásában.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

A magasabbrendű növényekben az auxin által szabályozott jelátviteli folyamatok szabályozzák a gravitropizmust, a gyökér morfológiáját, az embrió fejlődést, de befolyásolják a különböző környezeti hatásokra adott élettani és fejlődésbiológiai válaszokat. Habár az auxin szabályozásról rengeteg információ áll rendelkezésünkre, a jelátviteli folyamatok részleteinek megértésétől még messze vagyunk. Az utóbbi évtizedben kiderült, hogy az auxin különböző szövetekben lévő eloszlása számos fejlődésbiológiai mechanizmust befolyásol. Ezért azok a gének, amelyek az auxin transzportot befolyásolják kulcs fontosságúak az auxin hatások szabályozása szempontjából. A csoportunkban felfedezett CRK5 protein kináz is egy ilyen szabályozó faktor, ami az auxin transzportot közvetítő PIN fehérjék aktivitásának módosításával határozza meg a sejtek közötti az auxin áramlást. Ezáltal a CRK5 számos növekedési, egyedfejlődési mechanizmust befolyásol.
A kutatási programunkban a CRK5 által szabályozott auxin transzport és jelátvitel új aspektusait szeretnénk feltérképezni, megismerni. Azonosítani és jellemezni fogjuk azokat a fehérjéket amelyek a CRK5 foszforiláció célpontjai, és/vagy amelyek kölcsönhatnak a CRK5 kinázzal. Ezen faktorok megismerése révén várhatóan jobban meg tudjuk érteni az auxin által szabályozott molekuláris és fejlődésbiológiai folyamatokat. Ezek közül a gravitropizmus, a gyökérfejlődés és morfológia, a külső hatásokra bekövetkező változások szabályozása gyakorlati szempontból is fontos. A gravitropizmus határozza meg a gyökér és szárfejlődés irányát, ami létfontosságú a növények számára. A gravitropikus jelátvitel felderítését célzó kísérletek jelentőségét jelzi, hogy az Európai Űrügynökség (ESA), illetve az Amerikai Űrügynökség (NASA) is jelentős összegeket áldoz az ilyen típusú kutatásokra. A gyökér fejlődése, morfológiája határozza meg a tápanyag és vízfelvételt, befolyásolja a szárazságtűrést vagy a tartalék tápanyagok raktározását. A nagyobb, mélyebb, dúsabb gyökérrendszer jobb tápanyagfelvételt, a mélyebben levő vízkészletekhez való hozzáférést teszi lehetővé. Az ilyen növények jobban ellenállhatnak a kedvezőtlen környezeti hatásoknak, mint például a hazánkban is gyakori nyári aszály idején fellépő vízhiánynak.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média illetve az adófizetők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI számára.

A földi gravitáció minden élőlényre hatással van. A növények esetében a gyökér a Föld középpontja felé tart, míg a hajtás ezzel ellentétesen a Nap felé növekszik. Felmerül a kérdés, hogy milyen folyamatok játszódnak le ilyenkor? Charles Darwin óta, aki először írta le a gyökér és hajtás pozitív, illetve negatív gravitropikus válaszait, közel kétszáz év kísérletes élettani és molekuláris vizsgálatai ma már némi betekintést adtak a földi gravitációt érzékelő növényi mechanizmusokba. Felfedezték, hogy mind a szár mind a gyökér egy speciális régiója felelős az adott szerv gravitációs érzékeléséért. A kutatók kapcsolatot találtak egy növényi hormon, az auxin sajátos eloszlása és a geotropikus válaszok között. A modern növénybiológiában a legfontosabb modellnövény a lúdfű (Arabidopsis thaliana), amit széles körben használnak tudományos kutatások céljaira. Kutatócsoportunk előzetes adatai arra utalnak, hogy a CRK5 nevű protein kináz fontos az Arabidopsis gyökér és a szár geotropizmusának szabályozásához. Jelen pályázat a CRK5 kináz biológiai illetve molekuláris funkciójának kiderítését célozza. Biokémiai módszereket alkalmazva szeretnénk megtalálni a CRK5 kinázzal kölcsönható, a geotropizmust szabályozó fehérjéket. Egy új molekuláris módszer segítségével próbáljuk azonosítani azokat a fehérjéket, melyeket a CRK5 kináz foszforilál és ezáltal módosítja működésüket. Proteomikai analízissel szeretnénk meghatározni a kináz által foszforilált fehérjék aminosav oldalláncait, amelyek a módosítás elsődleges célpontjai. Kutatásaink eredményeképpen várhatóan pontosabb képet kaphatunk a CRK5 kináznak a szár és gyökér gravitropizmusának és fejlődésének szabályozásában betöltött szerepéről.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

By sensing the Earth’s gravity, higher plants adjust the growth of their shoots and roots with opposite polarity, which is controlled by the direction of gravity vector and the asymmetric distribution of the plant hormone auxin. Our previous study revealed that crk5-1 mutant displays delayed geotropic responses and reduced elongation of primary roots with more lateral roots. This phenotype is the result of altered auxin distribution caused by abnormal localization of PIN2 auxin efflux protein, which is phosphorylated by CRK5. The aim of our proposed research is to reveal the role played by CRK5 in geotropism and root development. To achieve this goal we will identify and characterize proteins which are phosphorylation substrates of CRK5 kinase and/or interact with it. CRK5-phosphorylated amino acid residues of PIN transporters and other target proteins will be identified by proteomic methods. To study the function of such modifications point mutations will be generated which can block or mimic the phosphorylation. Biological significance of CRK5-mediated protein phosphorylation will be studied by expressing these mutant proteins in transgenic plants. CRK5-interacting proteins will be identified by biochemical/proteomic methods, using immunprecipitation (pull-down) technique followed by mass spectrometry analysis. Protein interactions will be characterized by bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in plant cells. The results of the proposed research are expected to contribute to the better understanding of signal transduction pathways controlled by CRK5.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

In higher plants the negative gravitropic responses of shoots and positive responses of roots are controlled by the asymmetric distribution of the plant hormone auxin. The CRK5 protein kinase was previously identified in our earlier research program and was found to play an important role in the regulation of gravitropism. In the absence of CRK5 activity in the crk5-1 mutant, plants are unable to respond to the alterations of gravity. The aim of my research proposal is to reveal the function of CRK5-mediated protein phosphorylation in plant development and in control of physiological responses to environmental stimuli, such as gravity. In order to achieve this goal, I will try to identify the phosphorylation target proteins of the of CRK5 kinase. Besides, I will attempt the identification of those proteins which can interact with this kinase. Characterization of the CRK5-phosphorilated proteins will include the identification of those amino acid residues which can be altered by phosphorylation. Finally I will try to characterize the biological function of CRK5-mediated protein phosphorylation by specifically altering phosphorylation sites using targeted mutagenesis. Through the identification and characterization of interacting protein partners and phosphorylation targets I hope we can get more accurate information about the control of geotropism and developmental processes which are regulated by CRK5.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

In higher plants gravitropism, root morphology and embryo development are controlled by auxin regulated signal transduction processes, which also influence physiological or developmental responses caused by different environmental effects. Although plenty of information is available about auxin regulation, we are still far from complete understanding of the related signalling processes. As revealed in last decade, distribution of auxin in different tissues affects a number of developmental processes. Therefore genes influencing auxin transport are pivotal for the proper regulation controlled by auxin. The CRK5 protein kinase, identified in our group, is an important regulatory factor that controls the intercellular auxin flow via alteration of PIN protein activity, a group of auxin transport mediating proteins. In our research programme we aim to reveal new aspects of auxin transport and signal transduction regulated by CRK5 kinase. We will identify and characterize phosphorylation targets and/or interacting partner proteins of the CRK5 kinase. Obtaining information on these factors is expected to lead to better understanding of molecular and developmental processes regulated by auxin. A regulation of auxin-dependent processes such as gravitropism, root development and morfology, or response to external stimuli is also important from practical point of view. Gravitropism determines the direction of root and shoot development, which is of vital importance for plants. The fact that the European Space Agency (ESA) and the National Aeronautics and Space Administration (NASA) dedicate a significant amount of funds on research aiming gavitropic signal transduction indicates the importance of the aforementioned studies. Water and nutrient uptake is determined by root development and morphology, which influence drought tolerance or nutrient storage as well. Greater, deeper, more abundant root system enables plants to better nutrient uptake, and better access to deep-lying water supplies. Such plants could better tolerate unfavourable environmental effects, like water shortages frequently occurring in our country during summer droughts.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NKFI in order to inform decision-makers, media, and the taxpayers.

Earth’s gravity affects all kind of organisms. In case of plants roots grow towards the centre of Earth, while shoots aim to the opposite, towards the Sun. It is intriguing to decipher, what kind of mechanisms control these processes, which was first reported by Charles Darwin? Two hundred years of experimental physiological and molecular investigation gave us some insight into the plant processes related to gravity sensing and regulation of positive and negative geotropic responses in roots and shoots respectively. A specific region of both shoots and roots was discovered to be responsible for the gravity sensing. A connection was found between the special distribution of a plant hormone auxin, and geotropic responses. In modern plant biology, thale cress (Arabidopsis thaliana) is the most important model organism, which is widely used for scientific research purposes. Preliminary data obtained by our research group suggested that the protein kinase CRK5 is important to control the root and shoot geotropism of Arabidopsis. The aim of the present project is to reveal the biological and molecular functions of CRK5 kinase. Using biochemical approaches we wish to find the protein interaction partners of CRK5 kinase, regulatory proteins which can control geotropism. Using a new molecular technology, we try to identify those proteins which could be phosphorylated by CRK5. Employing sensitive proteomic analysis we will identify the amino acid side chains of target proteins which are phosphorylated by CRK5 kinase. As a result of our research efforts we expect to gain better understanding of the role of CRK5 kinase played in root and shoot geotropism and developmental regulation.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
Jelen kutatás keretében a CRK5 Arabidopsis kináz szerepét próbáltuk felderíteni az auxin jelátvitelben. Az auxin PIN transzporter fehérjék sejten belüli elrendeződésében, stabilitásában fő szerepet játszik az úgynevezett hidrofil hurok (HL) régiójának a foszforilációja. A kísérleteink során 3 PIN fehérjének, a PIN1, PIN2 és a PIN3 HL régióját vizsgáltuk. Azonosítottunk több, CRK5 specifikus foszforilációs helyet: 2 a PIN1, körülbelül 15-öt a PIN2, és 12 helyet PIN3 HL régiójában. A lehetséges foszforilációs helyek szerepének felderítéséhez, Alaninra (inaktív) vagy Asparaginsavra (folyamatosan aktív), terveztük módosítani a helyeket, de nem sikerült előállítani a módosított konstrukciókat, többféle módszert kipróbálva sem. Előállítottuk a CRK5 kináz analóg-érzékeny variánsait, mely segítségével lehetőség nyílt foszforilációs partnerazonosításra. Azonban az alkalmazott módosítások következtében a CRK5 kináz aktivitását elvesztette, így a használni kívánt kísérleti rendszerünkben nem használható. A gCRK5-GFP konstrukciót tartalmazó növényvonalakt felhasználva, sikeresen azonosítottuk a CRK5 kináz lehetséges kölcsönható partnereit, melyet bimolekuláris fluoreszcencia komplementációs technikával ellenőriztünk le. Kutatásunkat kiterjesztettük a CRK család többi tagjának jellemzésére is. Eredményeinket egy publikációban foglaltuk össze. A crk5 kináz embriófejlődésben, csírázásban betöltött szerepét is sikerült felderíteni, mely eredményeket két cikkben tervezzük az idén publikálni.
kutatási eredmények (angolul)
In the framework of present research, our aim was to explore the role of CRK5 Arabidopsis kinase in auxin signalling. The phosphorylation of so-called hydrophilic loop (HL) region plays a major role in the intracellular arrangement and stability of auxin PIN transporters. In the course of our experiments the HL regions of 3 PIN proteins: PIN1, PIN2 and PIN3 were examined. We have identified several CRK5 specific phosphorylation sites: 2 in PIN1, approx. 15 in PIN2, and 12 in the HL region of PIN3. In order to discover the role of possible phosphorylation sites we planned to modify these sites to Alanin (inactive) or Asparagic acid (continuously active), but the production of the constructs was failed despite of trying different methods. Analog-sensitive variants of the CRK5 kinase have been prepared, allowing the identification of a phosphorylation partners. However, as a result of the applied modifications, the activity of CRK5 kinase was lost, so it is unusable in our experimental system.With the aid of plant lines containing the gCRK5-GFP construct, we have successfully identified the possible interacting partners of the CRK5 kinase, which were verified by bimolecular fluorescence complementation.We have extended our research to characterize further members of CRK family as well. Our results were summarized in a publication. The role of crk5 kinase played in embryo development and germination was successfully revealed as well, and we plan to publish these results in two articles this year.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=128055
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
Abu Imran Baba, Ildikó Valkai, Nitin Labhane, Norbert Andrási, Laura Zsigmond, László Szabados, Attila Fehér, Gábor Rigó and Ágnes Cséplő: CRK5 protein kinase exhibits an essential role in embryogenesis of Arabidopsis thaliana, http://2019.hunlifesci.hu/programme/, 2019
Gábor Rigó, Lilla Koczka, László Szabados, Laura Zsigmond, Zsuzsanna Darula, Katalin Medzihradszky, Csaba Koncz, Ágnes Cséplő: Role of the Arabidopsis thaliana CRK5 protein kinase in the gravitropic response, http://2019.hunlifesci.hu/programme/, 2019
Rigó Gábor, Koczka Lilla, Cséplő Ágnes, Szabados László, Darula Zsuzsanna, Medzihradszky Katalin, Koncz Csaba: Determination of the Arabidopsis thaliana CRK5 protein kinase phosphorylation sites on the PIN1, PIN2 and PIN3 hydrophilic loop region, http://biogehu.com/wp-content/uploads/2016/04/17KBN_AbstractBook.pdf, 2016
Abu Imran Baba, Andrási Norbert, Rigó Gábor, Szabados László, Cséplő Ágnes: Involvement of the calcium-dependent protein kinase (CDPK)-related kinase CRK5 in regulation of gravitropic responses under de-etiolated conditions, http://biogehu.com/intezetek/magyar-biologiai-es-okologiai-intezet/kolozsvari-biologus-napok/17kbn/, 2016
Gábor Rigó, Lilla Koczka, László Szabados, Zsuzsanna Darula, Katalin Medzihradszky, Csaba Koncz, Ágnes Cséplő: Studying of the Arabidopsis CRK5 kinase function in the gravitropic response, http://hunlifesci.hu/tudomanyos-program/, 2017
Abu Imran Baba, Rigó, G, Koncz, Cs, Szabados, L, Cséplő Á,: Versatile functions of the CRK5 protein kinase during Arabidopsis thaliana growth and development, https://drive.google.com/drive/folders/0BwgRZWPERgy4WlI0YmhLclNsRXc?fref=gc&dti=306346439452070, 2017
Abu Imran Baba1,2, Gábor Rigó1,3, Ferhan Ayaydin1, Norbert Andrási1, Ateeq Ur Rehman1, János Urbancsok4, Laura Zsigmond1, Ildikó Valkai1, Imre Vass1, Taras Pasternak5, Klaus Palme5, László Szabados1 and Ágnes Cséplő1: Functional analysis of the Arabidopsis thaliana CDPK Related Kinase (CRK) family, www.brc.hu, 2018
Abu Imran Baba1, Gabor RIGÓ2, Ferhan AYAYDIN2, Norbert ANDRÁSI2, Ateeq ur REHMAN2, Janos URBANCSOk2, Laura ZSIGMOND2, Ildiko VALKAI2, Imre VASS2, Taras PASTERNAK2, Klaus PALME2, László SZABADOS2, Ágnes CSÉPLO2: Functional analysis of CDPK Related Kinase (CRK) family in Arabidopsis thaliana plant, www.europlantbiology2018.org, 2018
Baba A.I., Rigó G., Andrási N., Tietz O., Palme K., Szabados L., Cséplő A: Striving Towards Abiotic Stresses: Role of the Plant CDPK Super Family Members., Adaptation in Agriculture, Forestry and Water Resources Economy. ( in press), 2018
Baba, A.I.; Rigó, G.; Ayaydin, F.; Rehman, A.U.; Andrási, N.; Zsigmond, L.; Valkai, I.; Urbancsok, J.; Vass, I.; Pasternak, T.; Palme, K.; Szabados, L.; Cséplő, Á.: Functional Analysis of the Arabidopsis thaliana CDPK-Related Kinase Family: AtCRK1 Regulates Responses to Continuous Light., https://www.mdpi.com/1422-0067/19/5/1282, 2018
Gábor Rigó , Lilla Koczka , László Szabados, Zsuzsanna Darula , Katalin Medzihradszky , Csaba Koncz, Ágnes Cséplő: CRK5 kinase function in Arabidopsis thaliana, https://www.acpd2018.org/, 2018




vissza »