Itakonsav túltermelés Aspergillus terreus-ban, avagy fermentációs technológia a gomba élettanának szolgálatában  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
129602
típus KH
Vezető kutató Karaffa Levente
magyar cím Itakonsav túltermelés Aspergillus terreus-ban, avagy fermentációs technológia a gomba élettanának szolgálatában
Angol cím Itaconic acid overflow in Aspergillus terreus: HOW fermentation technology reflects metabolic needs
magyar kulcsszavak Aspergillus terreus, itakonsav, szerves sav termelés, fermentáció, Mangán ion, Réz ion
angol kulcsszavak Aspergillus terreus, itaconic acid, organic acid production, fermentation, Mn-ion, Cu-ion
megadott besorolás
Sejtbiológia, molekuláris transzportmechanizmusok (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)40 %
Mikrobiológia: virológia, bakteriológia, parazitológia, mikológia (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)40 %
Ortelius tudományág: Mikrobiológia
Analitikai kémia (Műszaki és Természettudományok Kollégiuma)20 %
Ortelius tudományág: Műszeres analitika
zsűri Sejt- és Fejlődésbiológia
Kutatóhely TTK Biomérnöki Tanszék (Debreceni Egyetem)
résztvevők Fábián István
Fekete Erzsébet
Molnár Ákos Péter
projekt kezdete 2018-10-01
projekt vége 2021-03-31
aktuális összeg (MFt) 19.538
FTE (kutatóév egyenérték) 3.75
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

Az itakonsavat (2-metilén butándisav, metilén szukcinát) a US Department of Energy a vegyipar számára legfontosabb 12, biotechnológiai úton előállított alapanyag egyikének választotta. A telítetlen dikarbonsavhoz kettős kötéssel kapcsolódó metiléncsoportja miatt az itakonsav könnyen polimerizálható, ami sokféle fontos vegyipari alkalmazás (műanyagok, kenőanyag adalékok, gyanták, hidrofób festékek, stb. előállítása) előtt nyitja meg a lehetőséget. Globális piacának mérete meghaladja az évi 200 millió US$-t. Az itakonsavat süllyesztett aerob fermentációs eljárással, az Aspergillus terreus fonalas gomba révén állítják elő. Az ipari léptékű technológia – folyamatos optimalizálása ellenére – több olyan lépést tartalmaz, melyek az egész eljárást megdrágító anyagi és/vagy munkaerő ráfordítást igényelnek. A két legfontosabb ezek közül a magas oldott oxigénszint illetve a táptalaj csaknem teljes mangán (II) ion mentességének biztosítása a fermentáció során. Az alapkérdések az A. terreus itakonsav fermentáció e két elemének tudományos magyarázatára, a jelenségek mögött lévő sejtélettani mechanizmusokra irányulnak, s egyben a folytatását jelentik egy 2015-ben megjelent, jelentős nemzetközi visszhangot kiváltó dolgozatban megjelent kutatásainknak. Az eredmények függvényében a fermentációs technológia eme két elemét megcélzó költségcsökkentő javaslatokat is megfogalmazunk majd.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

Az itakonsavat (2-metilén butándisav, metilén szukcinát) a US Department of Energy a vegyipar számára legfontosabb 12, biotechnológiai úton előállított alapanyag egyikének választotta. A telítetlen dikarbonsavhoz kettős kötéssel kapcsolódó metiléncsoportja miatt az itakonsav könnyen polimerizálható, ami sokféle fontos vegyipari alkalmazás (műanyagok, kenőanyag adalékok, gyanták, hidrofób festékek, stb. előállítása) előtt nyitja meg a lehetőséget. Az itakonsavat nagyléptékű, süllyesztett fermentációs eljárással, az Aspergillus terreus fonalas gomba révén állítják elő. Az ipari léptékű fermentációs technológia – folyamatos optimalizálása ellenére – több olyan lépést tartalmaz, melyek az egész eljárást megdrágító anyagi és/vagy munkaerő ráfordítást igényelnek. A két legfontosabb ezek közül a magas oldott oxigénszint illetve a táptalaj csaknem teljes mangán (II) ion mentességének biztosítása a fermentáció során. Kutatásaink az itakonsav fermentáció e két elemének tudományos igényű magyarázatára irányulnak. Mivel a Cu(II) ion koncentráció emelése a táptalajban jelentősen megemeli az itakonsav kihozatalt, I. Hipotézisünk szerint a Cu(II) és a Mn(II) ionok hatása antagonisztikus, melynek oka a Cu(II) itakonsav és/vagy Mn(II) transzporterrel való kölcsönhatásában keresendő. II. Hipotézisünk az itakonsav fermentáció magas oldott oxigénigényére irányul, és azt feltételezi, hogy az A. terreus rendelkezik aktív alternatív oxidáz enzimmel – szerepe a lebontó anyagcsere ATP általi gátlásának megakadályozása. Az alternatív oxidáz oxigén iránti affinitása ugyanis minden vizsgált esetben jóval alacsonyabb a citokróm-függő oxidázokénál, vagyis működése magas oxigénszintet igényel.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

Az itakonsav (2-metilén butándisav, metilén szukcinát) egy biotechnológiai úton előállított, fontos vegyipari alapanyag; műanyagok, kenőanyag adalékok, gyanták, hidrofób festékek alkotórésze. Süllyesztett, aerob fermentációs eljárással állítják elő, az Aspergillus terreus fonalas gomba révén. Az ipari léptékű technológia – folyamatos optimalizálása ellenére – több, fokozottan költséges lépést tartalmaz. A két legfontosabb közülük a magas oldott oxigénszint biztosítása a fermentáció során, illetve az itakonsav kihozatalt csökkentő mangán(II) ionok csaknem teljes eltávolítása a táptalajból. Pályázatunk az A. terreus itakonsav fermentáció e két elemének tudományos igényű magyarázatára, a jelenségek mögött lévő sejtélettani mechanizmusokra irányul, s egyben a folytatását jelentik egy 2015-ben megjelent, jelentős (pozitív) nemzetközi visszhangot kiváltó dolgozatban megjelent munkánknak, melyben elsőként mutattunk rá a Mn(II) ionok kritikusan fontos szerepére az A. terreus itakonsav fermentáció során. A kapott eredmények függvényében a fermentációs technológia eme két elemét megcélzó költségcsökkentő javaslatokat is megfogalmazunk. Interdiszciplináris (mikrobiológusokat, biomérnököket, vegyészeket is tagjai között tudó) kutatócsoportunk a felmerülő komplex tudományos kérdéseket intellektuális és technikai szempontból is képes lesz magas szinten megközelíteni, rájuk válaszokat megfogalmazni – ez talán a pályázat legfőbb erőssége a versenytársakhoz képest. A Debreceni Egyetem TTK Biomérnöki Tanszékének Kísérleti Fermentációs Üzemében lehetőség van továbbá az ipari léptékű itakonsav fermentáció komplett leképezésére és egységes tanulmányozására. Kutatásaink tágabb értelmű tudományos jelentősége a primer metabolitok túltermelésének jobb, megértése, az eukarióta sejt általános szabályozó mechanizmusainak részletesebb megismerése lesz.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.

A vegyi anyagok túlnyomó részét fosszilis alapanyagok (elsősorban a kőolaj) kémiai átalakítása révén nyerjük. A kőolaj kitermelésével, szállításával és finomításával kapcsolatos nehézségek miatt érthető a mikroorganizmusok metabolikus aktivitására épülő biotechnológiai eljárások iránti érdeklődés. Az itakonsavat a US Department of Energy a vegyipar számára legfontosabb 12, biotechnológiai úton előállított alapanyag egyikének választotta, köszönhetően sokféle, fontos alkalmazásának (műanyagok, kenőanyag adalékok, gyanták, hidrofób festékek előállítása). A globális itakonsav piac mérete ~ 90.000 tonna, értéke ~ 200 millió US$. Az itakonsavat fermentációs eljárással, az Aspergillus terreus fonalas gomba révén állítják elő. A technológia több olyan lépést tartalmaz, mely aránytalanul nagy anyagi és/vagy munkaerő ráfordítást igényel. A két legfontosabb ezek közül a gombatenyészet magas oldott oxigénigényének és a táptalaj csaknem tökéletes mangán (II) ion mentességének biztosítása a fermentáció teljes időtartama során. Az oldott oxigénszint biztosítása a több száz köbméter térfogatú fermentorok mechanikus keverőit működtető, nagyteljesítményű villanymotorok áramfelvétele miatt a technológia legköltségesebb eleme, a Mn(II) ionok eltávolítása pedig idő- és munkaigényes. Kutatásaink az itakonsav fermentáció ezen elemei mögött lévő lehetséges biológiai okok vizsgálatára irányulnak; a kapott eredmények függvényében költségcsökkentő javaslatokat is megfogalmazunk majd.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

Itaconic acid (2-methylidenebutanedioic acid, 2-methylenesuccinic acid) was rated as one of the top 12 value-added products to industrial biotechnology by the US Department of Energy. It contains two carboxyl groups, a conjugated double bond and a methylene group, that makes it prone to being polimerized. As a consequence, it frequently serves as a building block for the synthesis of chemicals with a broad range of applications, such as plastics, lubricants, resins and hydrophobic dyes, with a combined annual global market exceeding US$ 200 million. Industrial production of itaconic acid occurs entirely by submerged, aerobic fermentation using the fungus Aspergillus terreus. This large-scale technology, despite of its continuous optimization, still contains steps that are disproportionately expensive and/or laborous, the two most important being the high dissolved oxygen requirement and the need to almost completely eliminate manganese(II) ions from the growth medium at the onset of the fermentation. The fundamental questions of this research proposal are focusing on the scholarly explanation of the underlying cell physiology behind these two elements of itaconic acid fermentation, and constitute the continuation of our research that resulted in a well-received paper from 2015. Depending on the results, we might even be able to formulate suggestions for cost-reduction on these designated areas.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

Itaconic acid (2-methylidenebutanedioic acid, 2-methylenesuccinic acid) is one of the most promising bio-based product to the chemical industry. It contains two carboxyl groups, a conjugated double bond and a methylene group. As a consequence, it frequently serves as a building block for the synthesis of polimers with a broad range of applications, such as plastics, lubricants, resins and hydrophobic dyes, with a combined annual global market of over 200 million US$. Industrial production of itaconic acid occurs entirely by large-scale submerged fermentation using the fungus Aspergillus terreus. This large-scale industrial technology, despite of its continuous optimization, still contains steps that are disproportionately expensive and/or laborous. The two most critical ones are the high dissolved oxygen supply and the prerequisite to eliminate manganese(II) ions almost completely from the growth medium at the onset of the fermentation. In contrast, increasing Cu(II) ion concentration in the growth medium enhances itaconic acid yield. According to Hypothesis I., Mn(II) and Cu(II) ions play an antagonistic role in the overflow process, and the ability of the Cu(II) ions to antagonize the harmful effect of Mn(II) ions may be due to an interplay between them and the Mn(II) and/or itaconic acid transporter proteins. Hypothesis II focuses on the high dissolved oxygen requirement of the culture, and proposes a crucial role to the operation of the alternative oxidase enzyme by preventing an inhibition of carbon catabolism by ATP. Affinity of the alternative oxidase towards oxygen is always lower than that of the cytochrome-dependent oxidase, hence it requires high oxygen levels.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

Itaconic acid (2-methylidenebutanedioic acid, 2-methylenesuccinic acid) is an important bio-based feedstock for the chemical industry, frequently serving as building block for the synthesis of polimers with a broad range of applications, such as plastics, lubricants, resins and hydrophobic dyes. It is produced entirely by aerobic, submerged fermentation employing the fungus Aspergillus terreus. This large-scale industrial technology, despite of its continuous optimization, still contains steps with disproportionate costs. The two most critical ones are the massive dissolved oxygen requirement and the prerequisite to eliminate manganese(II) ions almost completely from the growth medium at the onset of the fermentation. This research proposal focuses on the scholarly explanation of the cell physiology behind these two elements of itaconic acid fermentation, and constitute the continuation of our research that resulted in a well-received paper from 2015, in which we described for the first time the detrimental effect of Mn(II) ions to itaconic acid yield. Depending on the results, we might even be able to formulate suggestions for cost-reduction on these designated areas. Our interdisciplinary research group comprised of microbiologists, biochemical engineers and chemists will be capable of approaching the emerging, complex scientific issues on a high professional standard both intellectually and technically. This may be the biggest advantage of this proposal over our competitors. Moreover, the state-of-the art infrastructure of the Fermentation Pilot Plant at the Department of Biochemical Engineering of the University of Debrecen would allow us to model itaconic acid fermentation in its entire complexity and to study it as a unified process. In the wider sense, our research would enable us to understand the metabolic overflow of primary metabolism and the general regulatory mechanisms of the eukaryotic cells in more details.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.

Currently, fossil materials (mainly crude oil) are still the most important feedstocks for the chemical industry, but issues regarding its exploitation, logistics and refinery made bio-based feedstocks – produced through microbial metabolic activity – a lucrative and rapidly growing alternative. Itaconic acid was rated as one of the top 12 value-added products to industrial biotechnology by the US Department of Energy due to its broad application spectrum such as plastics, lubricants, resins and hydrophobic dyes. Industrial production of itaconic acid occurs entirely by fermentation using the fungus Aspergillus terreus. Annual global itaconic acid production totals at around 90.000 tons that values some 200 million US$. Nonetheless, the technology has a few steps that are disproportionately expensive and/or laborous. The two most critical of those are the high dissolved oxygen requirement of the fungal culture that requires extensive agitation and, hence, massive power supply as well as the need to almost completely eliminate manganese(II) ions from the growth medium at the onset of the fermentation, which is time-consuming and laborous. Our research focuses on the biological reasons behind these elements of itaconic acid fermentation. Depending on the results, we might even be able to formulate suggestions for cost-reduction on these areas.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
Az itakonsav egy biológiai eredetű, megújuló polimeripari alapanyag. Az Aspergillus terreus fonalas gomba segítségével állítják elő süllyesztett fermentáció során. Szénforrásként melaszt vagy keményítőt használnak, de az élelmiszeriparban nem használt lignocellulóz alapú növényi biomassza hasznosítására irányuló kutatások egyre fokozódnak. Munkánk során azt vizsgáltuk, hogy a glükóz alapú itakonsav fermentáció két kritikus paramétere – a mangán(II) ionok hiánya és a szénforrás magas kiindulási koncentrációja – a lignocellulóz legfontosabb monomerjén, a D-xilózon is előfeltétel-e. Az eredmények azt mutatták, hogy a Mn(II) ionok hatása hasonló az itakonsav termelésre, mint D-glükózon: maximális hozamot 3 µg/L Mn(II) ion koncentráció alatt lehet csak elérni, ez az érték azonban csak 0.63 % (mól/mól). Szemben a D-glükóz alapú fermentációval, a D-xilóz kiindulási koncentráció 50 g/L fölé emelése nem növelte a hozamot. Magasabb külső Mn(II) ion koncentráció esetén az itakonsav hozam csökkent míg a biomassza hozam nőtt, a hatás azonban a táptalaj megemelt réz(II) ion koncentrációjával visszaszorítható volt. Az A. terreus kimagasló Cu(II) toleranciával rendelkezik, ami azonban a táptalaj Mn(II) szintjének csökkenésével csökken. Eredményeink rámutatnak, hogy a rézion fontos szempont a túltermelő anyagcsere szempontjából, és figyelembe kell venni a D-xilóz alapú A. terreus itakonsav fermentációk optimalizálása során.
kutatási eredmények (angolul)
Itaconic acid is a bio-based, renewable building block in the polymer industry. It is produced by submerged fermentations of the filamentous fungus Aspergillus terreus from molasses or starch, but research over the efficient utilization of non-food, lignocellulosic plant biomass is soaring. Here we tested whether the application of two key cultivation parameters for obtaining high itaconic acid yields from D-glucose – manganese(II) ion deficiency and high concentration of the carbon source – would also occur on D-xylose, the principal monomer of lignocellulose. The results obtained showed that the effect of Mn(II) ions on itaconic acid formation was similar to that on D-glucose and maximal yields were obtained below 3 µg/L Mn(II) ions which were, however, only 0.63 moles of itaconic acid per mole D-xylose. However, in contrast to the case on D-glucose, increasing D-xylose concentration over 50 g/L did not change the above yield. In the presence of higher external Mn(II) concentration itaconic acid yield decreased and biomass formation was favored, but this could be mitigated by increasing the copper(II) concentration in the medium. A. terreus displayed a very high tolerance to Cu(II) which, however, decreased when Mn(II) availability became limiting. Our results indicate that copper ions are relevant for overflow metabolism and should be considered when optimizing D-xylose based itaconic acid fermentation in A. terreus.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=129602
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
Ág N, Kavalecz N, Pénzes F, Karaffa L, Scazzocchio C, Flipphi M, Fekete E: Complex intron generation in the yeast genus Lipomyces, Scientific Reports, 10 Paper: 6022., 2020
Erzsébet Sándor, István Sándor Kolláth, Erzsébet Fekete, Vivien Bíró, Michel Flipphi, Béla Kovács, Christian Peter Kubicek, Levente Karaffa: Carbon-source dependent interplay of copper and manganese ions modulates the morphology and itaconic acid production in Aspergillus terreus, Frontiers in Microbiology, section Microbiotechnology, 2021
Fejes B, Ouedraogo J-P, Fekete E, Sándor E, Flipphi M, Soós Á, Molnár ÁP, Kovács B, Kubicek CP, Tsang A, Karaffa L: The effects of external Mn2+ concentration on hyphal morphology and citric acid production are mediated primarily by the NRAMP-family transporter DmtA in Aspergillus niger., Microbial Cell Factories, 19:17., 2020
KARAFFA L., KUBICEK C.P.: Citric acid and itaconic acid accumulation: variations of the same story?, Applied Microbiology and Biotechnology, DOI: 10.1007/s00253-018-09607-9., 2019
Kavalecz N, Ág N, Karaffa L, Scazzocchio C, Flipphi M, Fekete E: A spliceosomal twin intron (stwintron) participates in both exon skipping and evolutionary exon loss., Scientific Reports, 9: 9940., 2019
Kolláth IS, Molnár ÁP, Soós Á, Fekete E, Sándor E, Kovács B, Kubicek CP, Karaffa L: Manganese deficiency is required for high itaconic acid production from D-xylose in Aspergillus terreus, Frontiers in Microbiology, 10: 1589., 2019




vissza »