A SUCLA2 mutációk szerepe a mitokondrium foszforilációs rendszerének betegségeiben (EGT/Norvég Alap HU0069/NA/2006-2/PA-8)  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
78905
típus NNF
Vezető kutató Chinopoulos Christos
magyar cím A SUCLA2 mutációk szerepe a mitokondrium foszforilációs rendszerének betegségeiben (EGT/Norvég Alap HU0069/NA/2006-2/PA-8)
Angol cím The Role of SUCLA2 Mutations in the Disorders of the Mitochondrial Phosphorylation System
magyar kulcsszavak szukcinil-CoA szintetáz, adenin nukleotid transzlokáz, F0-F1 ATP-áz, bioenergetika, encefalomiopátia
angol kulcsszavak succinyl-CoA synthetase, adenine nucelotide translocase, F0-F1 ATPase, bioenergetics, encephalomyopathy
megadott besorolás
Anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok)34 %
Általános biokémia és anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok)33 %
Ortelius tudományág: Biokémia
Anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok)33 %
Ortelius tudományág: Metabolizmus
zsűri Élettan, Kórélettan, Gyógyszertan és Endokrinológia
Kutatóhely Orvosi Biokémiai Intézet (Semmelweis Egyetem)
résztvevők Dóczi Judit
Mándi Miklós
Törőcsik Beáta
projekt kezdete 2009-04-01
projekt vége 2011-03-31
aktuális összeg (MFt) 26.111
FTE (kutatóév egyenérték) 4.48
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A SUCLA2 gén kódolja a szukcinil-CoA-szintetáz enzim béta alegységét, amely szukcinil-CoA, illetve ADP szukcináttá és ATP-vé történő átalakulását katalizálja. A SUCLA2 mutációt hordozó betegek mtDNS deplécióban szenvednek, ami progresszív bioenergetikai elégtelenséget, neonatális enkefalomiopátiát okoz. A szukcinil-CoA-szintetáz egyedülálló abban az értelemben, hogy az egyetlen mátrix enzim, amely szubsztrát szintű foszforilációra képes. Felismertük, hogy a termelt ATP megnöveli a mitokondrális ATP kiáramlási hányadost és légzési láncot gátló vegyületek jelenlétében a mátrix szubsztrát szintű foszforilációja megakadályozza a citoszol ATP raktárának kiürülését. Tekintetbe véve azt, hogy a szukcinil-CoA-szintetáz ismert reguláció nélküli, reverzibilis enzim, feltételezzük, amennyiben mutációt szenved, az azonnali bioenergetikai következményeket von maga után a mitokondriális foszforilációs rendszerben. Dán kollaboráció során, Dr. Ostergaarddal együttműködve öt betegtől származó SUCLA2 mutáns fibroblaszt tenyészetet kaptunk. Ez az pályázat anyagi alapot teremthet ahhoz, hogy rágcsáló mitokondriumokon már alátámasztott eljárásainkat elvégezhessük ezeken a fibroblasztokon. Továbbá, immortalizálnánk ezeket a fibroblasztokat emberi telomeráz gén bejuttatásával. Szintén tervezzük SUCLA2 génkiütött egerek beszerzését, és siRNS technológiával elcsendesítve a SUCLA2 génexpressziót ellenőrizzük a hatást in situ a mitokondriális foszforilációs rendszerben. Ez a tervezet lefektetné a mitokondriális foszforilációs rendszerben a SUCLA2 gén kulcsfontosságú szerepének felismeréséhez szükséges alapokat, a kísérleti tervek széles skáláján; kezdve az izolált és in situ mitokondriumoktól a transzgenikus állatokon és siRNS in situ rendszereken át, egészen humán fibroblasztokig, öt különböző SUCLA2 mutációk géntermékeit vizsgálva.
angol összefoglaló
The SUCLA2 gene encodes the beta subunit of the mitochondrial enzyme succinyl-CoA synthetase, that catalyses the reversible conversion of succinyl-CoA and ADP to succinate and ATP. Mutations of this gene manifest as neonatal encephalomyopathy. Patients carrying SUCLA2 mutations suffer from mtDNA depletion, resulting in progressive bioenergetic failure. Succinyl-CoA synthetase is unique in a sense that it is the only matrix enzyme exhibiting ‘substrate-level phosphorylation’. We have recently identified that ATP produced in the matrix by this enzyme, boosts mitochondrial ATP efflux rate. We have also identified that in the presence of respiratory chain inhibition, matrix substrate-level phosphorylation prevents mitochondria from becoming a cytosolic ATP drain. Mindful that succinyl-CoA synthetase is a reversible enzyme with no known regulation, we reason that if mutated, that should have immediate bioenergetic implications of the mitochondrial phosphorylation system. Through collaboration with Dr. Ostergaard in Denmark, we obtained fibroblasts from 5 patients exhibiting SUCLA2 mutations. This proposal seeks funds to apply in these fibroblasts the same methods performed in mitochondria from rodents that led us to conclude that succinyl-CoA synthetase is a critical component of the mitochondrial phosphorylation system. We will also immortalize these fibroblasts by inserting a human telomerase gene. Furthermore, we plan to purchase the SUCLA2 knock-out mouse. Finally, by using siRNA technology we plan to silence the expression of SUCLA2 in cell cultures and check the impact on in situ mitochondrial phosphorylation systems. This project will lay the foundation of identifying SUCLA2 as a key participant of the mitochondrial phosphorylation system using experimental schemes ranging from isolated and in situ mitochondria from transgenic animals, to siRNA in in situ systems, to human fibroblasts harboring 5 different mutations involving the SUCLA2 gene product.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
Ami a SUCLA2 knock-out egerek használatát illeti, az állatok létrehozása még mindig folyamatban van, annak ellenére, hogy a kifizetés teljes egészében megtörtént. Amint megérkeznek az állatok, munkacsoportunk elsődleges feladata a tervben szereplő, eddig el nem végzett kísérletek végrehajtása lesz. Mindemellett jelentős előrehaladás történt két másik transzgenikus kolónia (DLD +/- és DLST +/-) tekintetében, mint azt a részletes jelentésben is leírtuk. A COS-7 és HEK293 sejteken tervezett siRNS-sel történő SUCLA2 elcsendesítést illetően eddig 4 különböző szekvenciát próbáltunk ki, de nem tapasztaltunk velük elcsendesedést. A citoszolikus/nukleáris ATP mérést illetően egy Japán kutatócsoport 11 plazmidot állított elő, melyekről kimutatták, hogy alkalmasak citoszolikus, nukleáris és mitokondriális ATP mérésére FRET alapú indikátorokként. A plazmidok nemrégiben érkeztek meg, jelenleg a mennyiség növelésén dolgozunk. A (iii) célkitűzést illetően, mely szerint SUCLA2 mutációban szenvedő betegek fibroblasztjain kísérletezünk: ezeket telomeráz gén általi immortalizálás nélkül felhasználtuk. Ahogyan azt az előzetes eredmények alapján is jósoltuk, azt találtuk, hogy SUCLA2 mutációban szenvedő betegekből származó fibroblasztok mitokondriumai gátolt légzési lánc mellett depolarizációt mutatnak bongkreksav hatására, ami az ANT korai megfordulására utal.
kutatási eredmények (angolul)
Regarding the aim using SUCLA2 knock out mice, this transgenic animal is still on the process of being generated, even though it has been paid in full. As soon as the mice will arrive in our facility, it will be a top priority to perform all remaining proposed experiments. However, significant progress on two other transgenic mouse colonies, DLD+/- and DLST+/-, as mentioned in the detailed progress report. Regarding siRNA against SUCLA2 in COS-7 and HEK293 cells, we have tried 4 different sequences; however, we have not observed any silencing. Regarding measurements of cytosolic/nuclear ATP, 11 plasmids have been generated by a Japanese group, shown to report cytosolic, nuclear, or mitochondrial ATP levels, operating as FRET-based indicators we have just obtained the plasmids, and we are currently expanding them in quantities. Regarding aim (iii), using fibroblasts from patients suffering from SUCLA2 mutations, we used them as such without immortalizing them by inserting a telomerase gene. Our findings showed that -as predicted by the preliminary results- fibroblasts obtained from patients suffering from SUCLA2 mutations exhibited bongkrekic acid-induced depolarizations in respiration-impaired in situ mitochondria, implying premature ANT reversals.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=78905
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
Doczi J, Turiák L, Vajda S, Mándi M, Töröcsik B, Gerencser AA, Kiss G, Konràd C, Adam-Vizi V, Chinopoulos C: Complex contribution of cyclophilin D to Ca2+-induced permeability transition in brain mitochondria, with relation to the bioenergetic state, J Biol Chem, 2011
Konràd C, Kiss G, Töröcsik B, Lábár JL, Gerencser AA, Mándi M, Adam-Vizi V, Chinopoulos C.: A distinct sequence in the adenine nucleotide translocase from Artemia franciscana embryos is associated with insensitivity to bongkrekate and atypical effects of adenine nucleotides on Ca2+ uptake and sequestration, FEBS J, 2011
Chinopoulos C, Konràd C, Kiss G, Metelkin E, Töröcsik B, Zhang SF, Starkov AA: Modulation of F(0) F(1) -ATP synthase activity by cyclophilin D regulates matrix adenine nucleotide levels, FEBS J, 2011
Chinopoulos C: Mitochondrial Consumption of Cytosolic ATP: Not So Fast, FEBS Letters, 2011
Chinopoulos C: The ‘B space’ of mitochondrial phosphorylation, Journal of Neuroscience Research, 2011
Chinopoulos C, Adam-Vizi V: Mitochondria as ATP consumers in cellular pathology, Biochim Biophys Acta. 2009 Aug 26, 2009
Eugeniy Metelkin, Oleg Demin, Zsuzsanna Kovács and Christos Chinopoulos: Modeling of ATP-ADP Steady-State Exchange Rate Mediated by the ANT in Isolated Mitochondria, FEBS J, in press, 2009
Chinopoulos C, Gerencser AA, Mandi M, Mathe K, Töröcsik B, Doczi J, Turiak L, Kiss G, Konràd C, Vajda S, Vereczki V, Oh RJ, Adam-Vizi V.: Forward operation of adenine nucleotide translocase during F0F1-ATPase reversal: critical role of matrix substrate-level phosphorylation., FASEB J. 2010 Jul;24(7):2405-16, 2010
Chinopoulos C, Adam-Vizi V.: Mitochondrial Ca(2+) sequestration and precipitation revisited., FEBS J. 2010 Jul 26, 2010
Chinopoulos C, Adam-Vizi V.: The 'ins and outs' of Ca(2+) in mitochondria., FEBS J. 2010 Jul 26, 2010
Kawamata H, Starkov AA, Manfredi G, Chinopoulos C.: A kinetic assay of mitochondrial ADP-ATP exchange rate in permeabilized cells., Anal Biochem. 2010 Dec 1;407(1):52-7, 2010




vissza »