A citrátciklus enzimek és a ciklofilin D mitokondriális foszforilációban betöltött szerepének megvilágítása transzgénikus egértörzsek felhasználásával  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
85658
típus NNF2
Vezető kutató Chinopoulos Christos
magyar cím A citrátciklus enzimek és a ciklofilin D mitokondriális foszforilációban betöltött szerepének megvilágítása transzgénikus egértörzsek felhasználásával
Angol cím Elucidating the contribution of citric acid cycle enzymes and cyclophilin D in mitochondrial phosphorylation potential using multiple transgenic mice strains
magyar kulcsszavak alpha ketoglutarat dehidrogenaz, malat dehidrogenaz, bioenergetika, szubsztrat szintu foszforilacio, adenin nukleotid transzlokaz, F0-F1 ATP szintaz
angol kulcsszavak alpha ketoglutarate dehydrogenase, malate dehydrogenase, bioenergetics, substrate-level phosphorylation, adenine nucleotide translocase, Fo-F1 ATP synthase
megadott besorolás
Anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok)45 %
Anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok)45 %
Ortelius tudományág: Metabolizmus
Sejtszintű és molekuláris neurobiológia (Orvosi és Biológiai Tudományok)10 %
zsűri Élettan, Kórélettan, Gyógyszertan és Endokrinológia
Kutatóhely Orvosi Biokémiai Intézet (Semmelweis Egyetem)
résztvevők Kiss Gergely
Konrád Csaba
Törőcsik Beáta
projekt kezdete 2011-04-01
projekt vége 2012-03-31
aktuális összeg (MFt) 6.398
FTE (kutatóév egyenérték) 2.43
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A citrátkör enzimeinek defektusai – különös tekintettel az α-ketoglutarát-dehidrogenáz komplexre (KGDHK) – elsősorban az Alzheimer-kórral (AD), de számos további krónikus megbetegedéssel is összefüggésbe hozhatóak. AD-ban szenvedett betegek post-mortem szöveteiben kimutatható csökkent KGDHK, és ezzel egyidejűleg emelkedett malát-dehidrogenáz aktivitás világosan alátámasztja ezeknek az enzimeknek a jelentőségét a betegség kóroktanában. A tervezett kísérletek elvégzését olyan transzgenikus egértörzsek létrehozása tette lehetővé, melyekben a következő genetikai módosítások mutatkoznak: i) KGDHK E2 (dihidrolipoil- transzszukciniláz, DLST) vagy E3 (dihidrolipoil-dehidrogenáz, DLD) alegység defektusban szenvedő egér, mitokondriális malát-dehidrogenáz (MDH2) deficiens egér, szukcinil-CoA-ligáz ATP-termelő alegység (SUCLA2) deficiens egér, ciklofilin D (cypD) -hiányos egér. Tervezzük: i) DLST+/- és DLD+/-, valamint SUCLA2+/- egerek keresztezését a cypD-/- egerekkel. Így 3 dupla knock-out törzset (DLST+/-cypD-/-, DLD+/-cypD-/- és SUCLA2+/-cypD-/-) létrehozva arra keresnénk választ, hogy a cypD genetikai deléciójával járó magasabb mátrix ATP/ADP arány kompenzálja-e a KGDHK E2 vagy E3 alegységét, ill. a SUCLA2-t kódoló egyik allél deléciójából eredő csökkent mátrix ATP/ADP arányt. ii) Kereszteznénk a DLST+/- és a MDH2+/- egereket, hogy az így létrehozott dupla knock-out (DLST+/-MDH2+/-) egéren azt vizsgáljuk, vajon az emelkedett MDH2 aktivitás megszűntetése egy DLST allél deléciójával együtt hasznos vagy éppen káros hatású. Ezen in vivo genetikai manipulációk által felfedhető lenne a KGDHK, a MDH2 és az ATP-termelő szukcinil-CoA-ligáz szerepe a mitokondriális foszforilációs potenciál kialakításában, és ezek az ismeretek hozzásegíthetnének minket azon betegségek patogenezisének jobb megértéséhez, melyekben a fenti enzimek érintettek. A cypD-hez kapcsolódó genetikai módosítások előnyös hatásai révén a későbbiekben ezen a területen is elsődleges farmakológiai célponttá válhat, ahogy ez már bekövetkezett más, nem szorosan ide kapcsolódó betegségekben esetén.
angol összefoglaló
Alterations in the activities of citric acid cycle enzymes, most notably of the alpha ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC), have been implicated in several chronic diseases, particularly in Alzheimer’s disease. A decrease in KGDHC activity in post-mortem tissues of patients with Alzheimer’s disease along with a concomitant increase in malate dehydrogenase activity underscore the significance of these enzymes to disease pathology. The proposed experiments will benefit from the availability of transgenic mice with deficiencies in the E2 (dihydrolipoyl succinyltransferase, DLST) or E3 (dihydrolipoyl dehydrogenase, DLD) subunit of KGDHC, mitochondrial malate dehydrogenase (MDH2), ATP-forming subunit of succinyl CoA ligase (SUCLA2), and cyclophilin D (cypD). We propose to: i) cross DLST+/-, DLD+/- and SUCLA2+/- mice with cypD-/- mice, thus generating three double knock-outs, DLST+/-cypD-/-, DLD+/-cypD-/- and SUCLA2+/-cypD-/-, and examine whether the greater matrix ATP/ADP ratios conferred by genetic deletion of cypD compensates for the decreased ATP/ADP ratios conferred by deletion of one of the alleles coding for the E2 or E3 subunit of KGDHC or the ATP-generating subunit of succinyl-CoA ligase; and ii) cross the DLST+/- mice with the MDH2+/- mice, thus generating the double knock-out DLST+/-MDH2+/- and examine whether the abolition of the increased MDH2 activity accompanying the deletion of one DLST gene allele is a rebound beneficial or an additive deleterious effect. These in vivo genetic manipulations will expose the contributions of KGDHC, MDH2 and ATP-forming succinyl CoA ligase in the mitochondrial phosphorylation potential, and as such contribute to a better understanding of the pathogenesis of diseases associated with alterations involving these enzymes. A beneficial effect obtained from involving cypD genetic manipulations will mark this protein as a primary target amenable to pharmacologic exploitation, an undertaking which currently enjoys success in combating unrelated human diseases.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
Az NNF2 85658-as pályázattal kapcsolatos előrelépések: i) A vad típusú, DLD +/- és DLST +/- egerekből nyert agy és máj eredetű izolált mitokondriumokon, izolált idegvégződéseken, kitenyésztett idegsejteken és asztrocitákon minden kísérletet elvégeztünk; ii) a DLD +/- DLST +/- dupla KO egerekből nyert agy és máj eredetű izolált mitokondriumokon és izolált idegvégződéseken a kísérletek nagy részét elvégeztük; iii) a DLD+/- cypD-/- dupla KO egerekből nyert agy és máj eredetű izolált mitokondriumokon minden kísérletet elvégeztünk. A DLST+/- cypD-/- dupla KO egerekkel még nem végeztünk kísérletet; iv) A SUCLA2 gén-kiütött egereket végül sikerrel létrehozták, Június 1-én érkezik 4 hím +/- és 4 nőstény +/- egér. SUCLA2 -/- egér ezidáig nem született (lehet, hogy perigasztrális elhalálozással jár); v) az MDH2 transzgenikus egerek (b variáns) nem mutattak csökkent MDH aktivitást, így nem kereszteztük őket egyik fenti törzzsel sem; vi) kísérleteink során arra a következtetésre jutottunk, hogy a légzési lánc cytochrome b5 reduktáza (cyb5r) az általunk tapasztalt jelenség fontos mediátora, és a PI elnyert egy kisebb pályázatot mely fedezi a cyb5r 2-es izoformára kiütött egérkolónia beszerzését az EUCOMM-tól. Jelenleg ezek az egerek szaporítás alatt vannak az EOK SPF állatházában. Kísérleteink rámutatnak a mitokondriális diaforázok fontosságára a mátrix NADH/NAD+ arány fenntartásában, mely témát a jövőben aktívan vizsgálni fogjuk.
kutatási eredmények (angolul)
The progress on grant NNF2 85658 is as follows: i) all experiments on isolated brain and liver mitochondria, isolated nerve terminals, and cultured neurons and astrocytes from WT, DLD+/-, DLST+/- mice have been completed; ii) most experiments on DLD+/- DLST+/- double KO mice have been completed on isolated brain and liver mitochondria, and isolated nerve terminals; iii) all experiments on DLD+/- cypD-/- double KO mice have been completed in isolated brain and liver mitochondria. No experiments have been performed yet on DLST+/- cypD-/- double KO mice; iv) the SUCLA2 mice have finally been generated, as of June 1st we have 4 male +/- and 4 female +/- mice. No -/- SUCLA2 mice have been born yet (perhaps this is associated with perigastrulation lethality); v) the MDH2 transgenic mice (b variant) did not exhibit a decreased activity in MDH, therefore they were not crossed with any of the other transgenic mice; vi) in the course of our experiments we deduced that an important component mediating the phenomena that we observed is the cytochrome b5 reductase (cyb5r) of the respiratory chain, and the PI won a small grant (waving the costs for obtaining a transgenic mouse colony) for obtaining cyb5r isoform 2 knock-out mice from EUCOMM. The mice are currently breeding in our SPF facility of the EOK. Our experiments point out the importance of mitochondrial diaphorases participating in the maintenance of matrix NADH/NAD pools, and this will be actively pursued in the future.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=85658
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
Gerencser AA, Chinopoulos C, Birket MJ, Jastroch M, Vitelli C, Nicholls DG, Brand MD: Quantitative measurement of mitochondrial membrane potential in cultured cells: calcium-induced de- and hyperpolarization of neuronal mitochondria, J Physiol. 2012 Apr 10, 2012
Kawamata H, Tiranti V, Magrané J, Chinopoulos C, Manfredi G: adPEO mutations in ANT1 impair ADP-ATP translocation in muscle mitochondria, Hum Mol Genet. 2011 Aug 1;20(15):2964-74, 2011
Chinopoulos C, Adam-Vizi V: Modulation of the mitochondrial permeability transition by cyclophilin D: moving closer to F(0)-F(1) ATP synthase?, Mitochondrion. 2012 Jan;12(1):41-5, 2012
Chinopoulos C: Mitochondrial consumption of cytosolic ATP: not so fast, FEBS Lett. 2011 May 6;585(9):1255-9, 2011
Csaba Konràd, Gergely Kiss, Beata Töröcsik, Vera Adam-Vizi and Christos Chinopoulos: Absence of Ca2+-induced mitochondrial permeability transition but presence of bongkrekate-sensitive nucleotide exchange in C. crangon and P. serratus, PLoS ONE, 2012




vissza »