Analytical Chemistry (Council of Physical Sciences)
50 %
Ortelius classification: Chemical and biosensors
Cardiovascular system (Council of Medical and Biological Sciences)
50 %
Panel
Chemistry 1
Department or equivalent
Institute of Materials and Environmental Chemistry (Research Center of Natural Sciences)
Starting date
2012-01-01
Closing date
2015-12-31
Funding (in million HUF)
11.285
FTE (full time equivalent)
3.20
state
closed project
Summary in Hungarian
A) Összefoglalás
A kutatási projekt összefoglalása
A projekt célja proteáz aktivitási mintázatok vizsgálata in vitro, három dimenziós komplex trombus modellekben. A munka során specifikus proteáz aktivitásokra érzékeny biomimetikus szenzorfelületeket fejlesztünk ki. Egy „mesterséges kapilláris” analógiára épülő mikrofluidikai rendszer kerül kifejlesztésre az in vivo erekben jelenlévő áramlási viszonyok figyelembe vételével.. Biomimetikus szubsztrát analógok alkalmazásával elektrokémiai nanoérzékelőket dolgozunk ki különféle szerin proteázok, így a plazmin, a szöveti eredetű plazminogén aktivátor és a neutrofil elasztáz vizsgálatára. A kidolgozott mikrofluidikai-elektrokémiai rendszer turbid fibrin kompozit környezetben történő újszerű alkalmazását tervezzük az optikai úton egyébként nem detektálható enzimreakciók meghatározása érdekében. A komplex trombus struktúrán belül végzett enzimaktivitás mintázat feltérképezése a napjainkban használatos trombolitikus terápia hatékonyságának növelésére adhat lehetőséget.
Kutatási kérdés
Hipotézis: A trombusban jelenlévő határfelületek jelentős hatással vannak a szerin proteázok fibrinbontó képességére. A háromdimenziós trombus modellben lejátszódó heterogén fázisú enzimatikus reakciók nem mutatnak homogén aktivitási mintázatot.
A tervezett kísérletekben a következő kérdésekre keressük a választ: • Hogyan befolyásolják a különböző enzimatikusan aktív és inaktív polimer (fibrin) valamint sejtkomponensek (vörös vértestek, leukociták) a trombuson belüli enzimktivitás eloszlást? • Befolyásolható-e a trombusokon belül kialakuló enzimaktivitás profil a szöveti eredetű plazminogén aktivátor vagy más szerin proteáz megfelelő adagolásával?
Milyen pontosan és milyen tartományban detektálható a proteázaktivitás szubsztrát analóg alapú elektrokémiai nanoszenzorokkal? Hogyan befolyásolja a miniatürizáció a szenzorfunkciót? Hogyan befolyásolják a szenzorok megbízhatóságát a mikrofluidikaiáramlási viszonyok?
A kutatás fontossága
Az atherothrombosis, magyarul az érelzáródás elsődleges jelentőségű halálozási ok szerte a világon. A jelenleg használatos vérrögoldási terápia során az enzimes fibrinoldás hatásosságát nehéz meghatározni a trombus komplex szerkezete miatt. Ha nem elegendő mennyiségű enzim jut a vérrög környezetébe, akkor az oldódási folyamat nem lesz megfelelő, az erek elzáródása nem szűnik meg. Az enzimes oldódást kiváltó aktivátor túladagolása esetén ugyanakkor jelentős vérzés léphet fel mellékhatásként. Az analitikai eszközök méretének valós fiziológiás folyamatok dimenziójába való csökkentése lehetőséget adhat az enzimatikus trombolízis mélyebb megértésére és a keringési megbetegedések jobb hatékonyságú kezelésének kidolgozására. A molekuláris biológiában alkalmazott újfajta szintézismódszerek, valamint a mikro- és nanotechnológiában használt újszerű és biomimetikus koncepció alapján folyó gyártástechnológiák lehetővé teszik olyan eszközök előállítását, amely segítégével, reményeink szerint, mélyebb betekintést nyerhetünk a trombuson belül zajó fibrinolitikus folyamatok molekuláris mechanizmusába.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Az érrendszeri elváltozások okozta érelzáródások, vérrögök megszüntetésének bevált módja a vérkeringésben egyébként is jelenlevő, természetes bontóenzimek alkalmazása. Ekkor ugyanaz a fehérje kerül nagy mennyiségbe a vérkeringésbe, mint amit a szervezet maga is előállít érfalsérülések gyógyulása után, a már szükségtelen hegek eltávolítására. A kóros folyamatok során keletkező vérrögök oldódásának azonban, a természetes folyamattal ellentétben, gyorsan kell végbemennie, hiszen a környező szövetek vérellátásának gyorsan kell helyreállnia. A hatóanyag megfelelő adagolása ilyen esetekben nem egyszerű feladat, a túl lassan oldódó vérrög maradandó károsodásokat okozhat, míg a túladagolás erős helyi vérzést idézhet elő. A kutatás célja az érelzáródások kezelésekor fellépő oldódási folyamatok jobb megértése és a folyamatok hatékonyságának növelése. E cél érdekében a mikroelektronika és nanotechnológia nyújtotta gyártás- és méréstechnológiát kihasználva, az emberi érrendszer méreteihez hasonló léptékben kialakított eszközt állítunk elő hatóanyag mennyiségének, aktivitásának meghatározása céljából. Az eszköz funkcionális kialakításakor szintén a mérendő rendszerhez, az érrendszerhez való hasonlóságot, a „biomimetikus” elvet követjük, a hatóanyag aktivitását a bontandó fehérjékhez hasonló molekulák hasadása alapján érzékeljük.
Summary
A) Summary
Summary of the research project
The aim of the project is to gain information on temporal three dimensional patterns of thrombus-related protease activities in in vitro thrombus models. A multianalyte sensor dedicated to the measurement of enzymatic processes is to be developed by using biomimetic approaches. Microfluidic system based on „artificial capillary” analogy will be used to simulate in vivo dynamic fluidic conditions present in real blood vessels. Biomimetic substrate-analogues will be used in electrochemical activity assay based nanoprobes for different serine proteases, such as plasmin, tissue-type plasminogen activator, elastase. Novel application of the integrated microfluidic electrochemical system for fibrin composite environment will give information on enzymatic activity inaccessible for optical assays of lysis. The accurate mapping of proteolytic activity in thrombus will lead to improved efficiency of currently used thrombolytic therapy.
Research question
Hypothesis: Interfaces present in a thrombus play important role in the fibrinolytic effect of serine proteases. Heterogeneous phase enzymatic reactions taking place at different locations in a three dimensional thrombus are not showing uniform pattern in activity.
Questions to be answered by experiments: • How different, enzymatically active and inactive polymeric (fibrin) and cellular (red blood cells, leukocytes) components affect the enzymatic activity distribution in the thrombus? • Can the enzymatic activity profile be influenced by rationalized tissue plasminogen activator or other serine protease dosage?
How accurately and in which range protease activity can be measured by substrate analogue electrochemical nanoprobes? How the function of these sensors will be affected as a result of miniaturisation? How microfluidic environment will influence the reliability of sensors?
Significance of the research
Atherothrombosis is a leading cause of death worldwide. Presently used thrombolytic therapy based on enzymatic dissolution of fibrin, building up much of the solid matrix of thrombus, has limitations due to the difficulties related to the determination of efficient dosage of fibrinolytic agents. Underestimated administration does not result in persistent recanalization of occluded blood vessels, on the other hand the efficient dosage often have significant bleeding side effect. Application of analytical tools scaled down to the dimensions of real physiological processes can lead to a deeper understanding of enzymatic thrombolysis and can result in more efficient therapy in ischemic cerebrovascular and cardiovascular diseases. Recent synthesis methods in molecular biotechnology, new fabrication techniques and biomimetic concepts in micro- and nanotechnology give the possibility to construct such miniaturized tools and to gain insight into fibrinolytic molecular processes.
Final report
Results in Hungarian
Trombusokban végbemenő fehérjebontó reakció elektrokémiai követésére alkalmas analitikai eszköz került kifejlesztésre, amely segítségével model és valódi trombusban végbemenő folyamatok is vizsgálhatóak. Lokális enzim reakciók mérésére plazmin enzim aktivitásra specifikusan érzékeny multi-elektród rendszer került alkalmazásra.
Az enzim reakcióprofil módosíthatóságát vizsgáltuk optimalizált proenzimhez adott aktivátor, illetve aktivált enzim adagolása esetén. A reakciófront haladási sebességében egyértelmű különbség mutatkozott, az adszorbeált proenzimhez adagolt aktivátor gyorsabb hasítást eredményezett, mint az aktivált enzim.
Neutrofil sejt eredetű trombus komponensek, így például DNS és hiszton hatásának vizsgálatára komplex gél oldódási sebességét mértük az elektródrendszer segítségével. Az oldódás különböző mértékben volt nehezített a tiszta fibrin, illetve a DNS-t és hisztont tartalmazó fibrin gélekben.
Teljes vérben történő mérésekre is történtek kísérletek proenzimmel gazdagított vérmintákban. A mérésekben szöveti plazminogén aktivátor adagolásának hatását vizsgáltuk az oldódási folyamat reakciófrontjának követésével, a tiszta fibrin gélben mérhető értékekkel való összehasonlításban.
A komplex, optikai úton nehezen vizsgálható trombus szerkezetben történő enzim aktivitás feltérképezésére alkalmas módszer lehetőséget nyújthat a trombolitikus terápia hatékonyságának jövőbeni növelésére.
Results in English
An analytical device was developped to follow up thrombolytic reaction front in model and real thrombi by electrochemical means. Multielectrode array sensor surfaces, sensitized for specific protease plasmin activity, has been used to detect locally the enzymatic action.
Possibility of enzyme activity profile manipulation in thrombi by optimized activator or enzyme dosage was investigated. Lytic front progress difference was well observable, the activator added to preadsorbed zymogen was initiating an accelerated cleavage compared to preactivated enzyme action.
Effect of clot components of neutrophil cell origin, such as DNA and histone, was investigated by following the complex gel lysis with the electrode system. A difference in lytic resistance could be observed between the fibrin gel and the complex DNA and histone containing fibrin systems.
Whole blood measurements were conducted with zymogen enriched blood samples, where effect of tissue plasminogen activator on lysis front was followed and was compared to model fibrin environment.
The method of enzyme activity mapping within a complex, optically hindered thrombus structure may provide an opportunity to increase the effectiveness of thrombolytic therapy.
Varjú I, Kolev K, Keresztes Z, Pap A, Tenekedjiev K, Machovich R: Fractal kinetic models of plasmin-catalyzed dissolution, JOURNAL OF THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS 11:(Suppl.2) pp. 791-792. (2013), 2013
Keresztes Z., Orosz E., Varjú I.,Mészáros G., Fekete Z., Nyikos L., Kolev K.: Real-time electrochemical detection of thrombolytic enzyme activity in thrombus model, 4th International Symposium on Sensor Science (I3S 2015), Basel, P59, pp. 169, 2015
Orosz E. , Varjú I., Mészáros G.,Fekete Z., Mező G., Csámpai A., Nyikos L., Kolev K., Keresztes Z.: Electrochemical follow-up of proteolytic enzyme activity in a thrombus model, Biosensors 2016, Goteborg, P2.103, 2016
Events of the project
2012-01-03 11:19:47
Kutatóhely váltás
A kutatás helye megváltozott. Korábbi kutatóhely: Nanokémiai és Katalízis Intézet (MTA Kémiai Kutatóközpont), Új kutatóhely: Anyag- és Környezetkémiai Intézet (MTA Kémiai Kutatóközpont).
