Konzorcium, társ p.: Újfajta 2-fotonos fotokémiai anyagok és szilicium karbid alapú nanomarkarek fejlesztése neuronhálózatok aktivitásának és a dendritikus jel integrációnak gyors, három dimenziós multi-foton mikroszkópiával történő mérésére  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
106043
típus K
Vezető kutató Perlné dr. Molnár Ibolya
magyar cím Konzorcium, társ p.: Újfajta 2-fotonos fotokémiai anyagok és szilicium karbid alapú nanomarkarek fejlesztése neuronhálózatok aktivitásának és a dendritikus jel integrációnak gyors, három dimenziós multi-foton mikroszkópiával történő mérésére
Angol cím Consortional assoc.: SDevelopment of novel silicon carbide nanomarkers and more effective glutamate and GABA uncaging materials for measurement of neuronal network activity and dendritic integration with three-dimensional real-time two-photon microscopy
magyar kulcsszavak glutaminsav, rendszerösszetevő bomlástermékek, HPLC, származékkészítés
angol kulcsszavak glutamic acid, system sourced decomposition products, HPLC, derivatization
megadott besorolás
Anyagtudomány és Technológia (kémia) (Műszaki és Természettudományok Kollégiuma)50 %
Analitikai kémia (Műszaki és Természettudományok Kollégiuma)40 %
Ortelius tudományág: Műszeres analitika
Szerves-, biomolekuláris- és gyógyszerkémia (Műszaki és Természettudományok Kollégiuma)10 %
Ortelius tudományág: Intermedierek kémiája
zsűri Idegtudományok
Kutatóhely Kémiai Intézet (Eötvös Loránd Tudományegyetem)
résztvevők Zsigrainé dr. Vasanits Anikó
projekt kezdete 2012-09-01
projekt vége 2017-08-31
aktuális összeg (MFt) 10.207
FTE (kutatóév egyenérték) 1.75
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

Ahhoz hogy megértsük az idegsejtek és idegsejt hálózatok jelintegrációjának működését, az aktivitást (azaz a kimeneteket) szimultán kell mérni több térbeli lokációban: idegsejtek dendritjeiben, axonjaiban illetve az ezekből felépülő neuronhálózatokban. Egy olyan új módszert fejlesztünk, amely képes a két-foton effektus segítségével 3D-ben egyszerre mérni és fotokémiailag aktiválni számtalan térbeli lokációban a jelenleg elérhetőknél lényegesen effektívebb GABA és glutamát fotokémiai anyagok és egy újfajta szilicium karbid alapú feszültség szenzor segítségével. A mikroszkóp nagy térfogatban (> 700x700x1400 µm3), és több mint 50/pont kHz-el lesz képes komplex téridőbeli szinaptikus bemeneti mintázatokat generálni az új fotokémiai anyagok segítségével, ezáltal lehetségessé válik a neuronhálózatokra jellemző komplex fiziológiás mintázatok reprodukálása. Másrészt ezzel párhuzamosan, a fenti nagy térfogatban és sebességekkel, lehetséges lesz a sejtek kimenetének, és a köztes információfeldolgozási állomásoknak is az egyidejű mérése. Hasonlóképpen nemcsak idegsejtek, hanem neuronhálózatok kimenet-bemenet karakterisztikáját is feltérképezhetjük. A fentiekben használt szilícium karbid (Si:C) feszültség szenzor nem toxikus, non-invazív és két-fotonosan is gerjeszthető, ezért vélhetően az idegtudomány, a biológia és az orvostudományok több területén kerülhet alkalmazásra.
A komplex metodikát arra használjuk ebben a projektben, hogy kvantitatívan megmérjük a neuronális jelösszegződés matematikai természetét komplex ideghálózati működés közben, egész konkrétan: az éles hullám (sharp wave) aktivitás alatt, amikor jellemzően összetett szinkron aktivitás érkezik 1-1 idegsejtre.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

Egy új metodikát szeretnénk kifejleszteni, amely lehetővé teszi a neuronális jelösszegződés szisztematikus vizsgálatát fiziológiásan releváns állapotokban, amikor a beérkező serkentő és gátló aktivitás meglehetősen magas. Ennek érdekében a jelenlegi 3D-s, valós-idejű, két-foton képalkotó rendszerünket egy gyors 3D-s fotokémiai aktivitást biztosító részegységgel szeretnénk kiegészíteni, amely képes lesz tetszőleges, komplex tér-időbeli szinaptikus input mintázat generálására. Mivel a 3D-s akuszto-optikai rendszer fényútjának áteresztőképessége meglehetősen alacsony (<5-10%), még a jelenleg kereskedelmi forgalomban egyedül elérhető glutamát fotokémiai anyag, az MNI-Glu, sem használható, mert túl alacsony a 2-foton abszorpciós hatásfoka. Továbbá az alacsony optikai hatásfok kompenzálását lehetővé tévő, a jelenlegieknél mintegy 10-20x nagyobb teljesítményű lézerek még nem lettek kifejlesztve, ezért szeretnénk a jelenlegieknél nagyobb hatékonyságú glutamát és GABA fotokémai anyagokat kifejleszteni.
Mérjük a két-foton hatáskeresztmetszetet, a spontán hidrolízist, az inaktívitást felszabadítás előtt és a fotokémiai sebességét.
Ha kimenet oldaláról közelítünk: nevezetesen, hogy térben megmérjük a bemenő mintázat keltette hatást, egy nem toxikus, stabil, fluoreszcens, szilicium karbid feszültség szenzort szeretnénk kifejleszteni, mivel a jelenleg használt Ca2+ jelet illetve elektrofiziológiai adatokat mérő módszerek térben nem megfelelően tükrözik a neuronális aktivitást. Mérni akarjuk az új anyag citotoxicitását, a membrán-jelölés hatásosságát, a festék dinamikus tartományát, a két-foton hatáskeresztmetszetet, a spektrális emissziót és a fluoreszencia élettartamot.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

Számos két-dimenziós két-foton mikroszkóp van a világon, ahol két-fotonos fotokémai felszabadítást használnak, de csak egyetlen fényre aktiválódó két-fotonos glutamát molekula, az MNI glutamát érhető el kereskedelmi forgalomban, és terjedt el a világban (Matsuzaki at al 2001), de még ez az anyag is alacsony két-fotonos hatáskeresztmetszettel rendelkezik, és ezért magas foto-toxicitása miatt a használhatóság határán van. A nagyobb hatásfokú anyagoknak nemcsak az az előnye, hogy kisebb a fototoxitiásuk, hanem, hogy használhatóakká válnak az új 3D-s lézer szkennelő két-foton mikroszkópunkban. A membránpotenciál szilíciumkarbid nanokristályokkal történő mérése teszi teljessé a képet, ezekkel az anyagokkal ugyanis lehetővé válik az idegsejtek lokális és globális kimenetének mérése, ezáltal neuronhálózatok jelintegrációjának szisztematikus feltérképezése egészen a bemeneteket jelentő szinaptikus aktivitások mérésétől a lokális dendritikus integrátorokon, átjátszó állomásokon keresztül egészen az idegsejtek kimenetéig.
Az első biológiai projekt, amit megvalósítunk az új metodikával, a dendritikus jelösszegződés három dimenziós, valós-idejű mérése lesz éles hullám (sharp wave) aktivitás alatt, amely új utat nyit, hiszen ez az első olyan projekt, ahol a sejt szintű jelösszegződést kvantitatívan mérjük fiziológiásan releváns komplex aktivitásmintázatok alatt.
Előzetes kísérleteinkben látjuk, hogy az ilyen globális integrációs szabályok (mint pl. SPW alatt) teljesen eltérőek az egy normál akut szeletben mérhetőekhez képest. A szilárdtest alapú szilikon karbid nanokristályoknak számtalan előnye van: nincs fototoxicitásuk, nem veszítik el intenzitásukat (bleaching) fény hatására és két-fotonosan is használhatók, továbbá az úgynevezett kvantum dotokkal ellentétben nem villognak.
A projekt jelentősége kulcsszavakban:
1) Új két-fotonos glutamát és GABA fotokémiai anyagok fejlesztése széles körű tudományos használatra.
2) Új, stabil, két-fotonos feszültség szenzorok fejlesztése számos tudományterület számára (idegtudomány, kardiológia, elektrofiziológia, fizika)
3) Új módszer: 3D-s, valós idejű, szimultán két-fotonos képalkotás és fotokémia.
4) A neuronális jelösszegződés megértése SPW aktivitás alatt.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.

Olyan in vivo fotostabil biomarkert fejlesztünk, amelyek érzékenyek az ideghálózat membránfeszültségére és szubmilliszekundumos felbontásban lehet képet alkotni vele két-fotonos mikroszkóppal. Ez az eszköz valódi áttörést hoz az agykutatásban: új horizontot nyitna mind az ideghálózat roncsolásmentes optikai diagnosztikájában, mind a gyógyszeriparban. Hosszabb távon a kutatócsoport szeretné továbbfejleszteni a technológiát és esetleg piacra lépni vele a sikeres kutatások után.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

To understand neuronal signal integration, activity (neuronal output) should be simultaneously recorded (and triggered) at many spatial locations in the dendritic and axonal tree of a single neuron and in assembly of neurons. We will develop a novel combined 3D two-photon uncaging and 3D two-photon imaging method which uses novel, more effective caged GABA and glutamatergic compounds and a new membrane voltage sensors made of silicon carbide nanocrystals for the systematic understanding of neuronal and network signal integration, computation. The 3D microscope will be able to generate spatiotemporally complex 3D input patterns in a large volume (> 700 x 700 x 1400 µm3) with high speed (at over 50/point kHz) using the novel caged compounds of increased efficiency 'mimicking' conditions characteristic to physiologically relevant network states. On the other hand, simultaneous recording of the output signal and the intermediate signal processing relay states (the dendritic computational subunits) can be performed in the same large volume with the same speed. Similarly, using the novel method, input-output characteristic on the level of neuronal networks can be mapped in 3D. The novel non-toxic, noninvasive, silicon carbide (Si:C) voltage sensor will have high two-photon action cross section and can be used in several field of neuroscience, biology and medicine.
This complex methodology will be used in the for the quantitative measurement of neuronal signal integration during complex network activity patterns such as sharp wave activity (SPW) where the bombardment of ongoing synaptic inputs generate rather complex dendritic and cellular activity.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

We would like to develop and use a novel method for systematic understanding of neuronal signal integration in physiologically relevant active states namely when the number of ongoing excitatory and inhibitory inputs is rather high. Therefore we would like to extend our 3D real-time two-photon imaging capacity (Katona et al Nature Methods 2012) with 3D two-photon uncaging to generate any kind of arbitrary temporally fast and spatially broad input pattern. Unfortunately, the transmission efficiency of the 3D acousto-optical pathway is quite low (<5-10%), therefore, the currently available caged glutamate (MNI-Glu) which has a rather low two-photon action cross section, could not be released in an adequately large volume. Furthermore, high power Ti:S lasers, with the required ~ 10-20-fold higher output power, are not available at high pulse repetition rate and the required wavelengths, therefore we would like to develop more effective caged glutamate and GABA compounds. We would like to measure two-photon action cross section, spontaneous hydrolysis rate, caging efficiency and speed of the two-photon induced release.
From the output side - namely for measuring the effect, the integration of the generated 3D input pattern - we would like to develop and validate new, non-toxic, stable, fluorescent, Si:C voltage sensors for two-photon imaging as currently used methodologies, such as Ca2+ imaging and electrophysiological recordings, do not properly report dendritic and neuronal activity in 3D. We would like to measure cellular toxicity, the efficiency of membrane labeling, dynamic range, two-photon cross section, spectral emission and fluorescence life-time.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

There is a number of two-dimensional setups where the methodology of photochemical activation (uncaging) is used, however, only one caged glutamate, the MNI-glutamate (Matsuzaki at al 2001) is commercially available and used widely for two-photon uncaging. Even so MNI-glutamate has a relatively low two-photon action cross section and its usability is close to the limit due to photo toxicity problems. The relevance of the more effective caged compounds is that they can be used with lower excitation power therefore photo toxicity is reduced; furthermore, the lower uncaging power required here allows the use of our novel 3D two-photon microscope concept (Katona et al 2012, Nature Meth.) for uncaging. Simultaneous measurement of the local membrane voltage, hence the local and global neuronal output, with the novel silicon carbide nanocrystals will complete the picture, therefore systematic understanding of the information transformation from ongoing synaptic inputs to the neuronal output - through a number of dendritic relay and computational subunits - will be possible. The first biological project, proposed here, namely the real-time measurement of dendritic computation during sharp wave ripples in 3D, will open new ways in neuroscience, as this is the first project when the signal integration will be quantitatively determined during physiologically relevant, complex network activity in the whole cell.
We have found in preliminary experiments that such global integration rules (e.g. during SPWs) are completely different from the local neuronal integration in acute slice. The solid-state silicon carbide membrane voltage sensor has numerous advantages compared to currently used voltage sensors: there is no photo-toxicity, no bleaching and can be used with two-photon excitation, furthermore, in contrast to solid state quantum dots, there is no blinking.
Relevance in keywords:
1) Novel caged glutamate and GABA materials for broad scientific use
2) Novel stable voltage sensors for two-photon imaging in several fields of science (neuroscience, cardiology, electrophysiology, physics)
3) Method for real-time simultaneous 3D uncaging and imaging
4) Understanding the mechanism of neuronal integration during SPWs.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.

We develop such photo-stable in vivo biomarker that is sensitive to the membrane voltage of the neuron-network and can be imaged by two-photon microscope within sub milliseconds resolution. This tool provides a true breakthrough in brain studies: it would open new horizon in both the noninvasive optical diagnostics of the neuron-network and the pharmaceutical industry. In the longer run, the research group intends to develop further the technology and possibly put into the market after the successful research.




vissza »