Genommérnöki módszerek fejlesztése az antibiotikum rezisztencia kialakulásának tanulmányozására  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
109572
típus PD
Vezető kutató Csörgő Bálint
magyar cím Genommérnöki módszerek fejlesztése az antibiotikum rezisztencia kialakulásának tanulmányozására
Angol cím Development of genome engineering approaches to study the evolution of antibiotic resistance
magyar kulcsszavak genommérnökség, antibiotikum rezisztencia, laboratóriumi evolúció
angol kulcsszavak genome engineering, antibiotic resistance, laboratory evolution
megadott besorolás
Biológiai rendszerek elemzése, modellezése és szimulációja (Orvosi és Biológiai Tudományok)50 %
Mikrobiológia: virológia, bakteriológia, parazitológia, mikológia (Orvosi és Biológiai Tudományok)40 %
Genomika, összehasonlító genomika, funkcionális genomika (Orvosi és Biológiai Tudományok)10 %
zsűri Genetika, Bioinformatika és Rendszerbiológia
Kutatóhely Biokémiai intézet (MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont)
projekt kezdete 2013-09-01
projekt vége 2016-08-31
aktuális összeg (MFt) 22.563
FTE (kutatóév egyenérték) 2.70
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

Az utóbbi években a bakteriális ún. genommérnöki eljárások rohamos léptékben fejlődtek. Az egyik legígéretesebb ilyen módszer a 2009-ben, Harvardon, George Church laborjában fejlesztett, ún. multiplex automatizált genommérnöki (MAGE) metódus. A technika lehetővé teszi, hogy egyidejűleg akár 50 különböző kiválasztott helyen módosuljon a genom egy adott sejten belül, így az eljárást ciklikusan ismételve, egy nap alatt több milliárd különböző mutáns genomot lehet létrehozni. A módszer új távlatokat nyit a célzott genomszerkesztés és analízis tárgyköreiben. Saját munkacsoportunkban közel egy éve kezdtük alkalmazni az eljárást, elsősorban a gyorsabb és precízebb genom módosítások elérésére. A MAGE kiváló módszernek bizonyult a laboratóriumunkban folyó antibiotikum rezisztencia kialakulásának tanulmányozására irányított kutatásokhoz. Segítségével bármilyen rezisztencia kialakulásáért felelős mutáció könnyen létrehozható és másokkal kombináltatható, így jelentős információ nyerhető az antibiotikumhoz való adaptálódás molekuláris mechanizmusairól. Célunk, hogy számos, klinikailag releváns antibiotikumhoz való adaptálódást, és az ezzel járó, más antibiotikumokkal szembeni keresztrezisztencia jelenségeket a módszer segítségével feltérképezzünk és megmagyarázzunk. Ezzel párhuzamosan maga a módszer bizonyos hátulütőit is próbáljuk kiküszöbölni. A MAGE módszer egyik legnagyobb hátránya, hogy a megfelelő hatékonyság elérése érdekében mutátor háttéren kell dolgozni, amely számos, nem kívánt mutációk kialakulásához vezet. Célunk, hogy speciális hőérzékeny DNS-javító enzimek segítségével a mutátor fenotípus ki-be kapcsolható legyen, így a másodlagos mutációk száma jelentősen csökkenthető.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

Alapvetően két, egymástól független, de később összekapcsolható kérdéskört fogunk kutatni. Először maga a multiplex automatizált genommérnöki (MAGE) eljárást szeretnénk tökéletesíteni. A módszer tulajdonsága, hogy a megfelelő hatékonyság elérése érdekében a DNS-hibajavító enzimeit nélkülöző törzseket kell használni, amely jelentős mutációs-ráta növekedést okoz. Ebből kifolyólag a kívánt, célzott módosításokon kívül számos járulékos mutáció is keletkezik, mely befolyásolhatja a vizsgált fenotípust. Erre a problémára keressük a megoldást, mégpedig hőérzékeny DNS-hibajavító enzimek felhasználásával. Hipotézisünk szerint a hőmérséklet változtatásával ki-be kapcsolható lesz a sejt DNS-hibajavító rendszere, így jelentősen lecsökkenthető lesz a háttér mutációk száma és összességében a módszer precizitása javulni fog. A precízebb MAGE módszer segítségével hatékonyabban tudjuk majd vizsgálni másik kérdéskörünket, nevezetesen az antibiotikum rezisztencia kialakulásáért felelős molekuláris mechanizmusokat. Munkacsoportunk egyik fő kutatási iránya a különböző, klinikailag releváns antibiotikumokkal szembeni rezisztenciák kialakulása, illetve az adaptált törzseknek más antibiotikumokkal szembeni érzékenységének a vizsgálata. A javított MAGE eljárásunkkal a rezisztenciákért felelős mutációkat könnyű szerrel tudjuk majd létrehozni és kombináltatni bármilyen nem-adaptált törzsben, így magyarázatokat kapunk az adaptációkért felelős molekuláris mechanizmusokról.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

A jelen pályázat jelentősége két különböző kérdéskör mentén fogalmazható meg.
1. A multiplex automatizált genommérnöki (MAGE) technika a szintetikus biológia területén egy nagyon jelentős áttörésnek számít. A mellett, hogy jelentős biotechnológiai és ipari alkalmazásai vannak, a molekuláris biológiai alapkutatásokban is új perspektívákat nyit. Segítségével a genomszerkesztés és analízis lehetőségei jelentősen kitágulnak és felgyorsulnak. A világ számos vezető kutatóintézetében alkalmazzák már a módszert vagy annak változatát, felhasználása rohamosan terjed. A módszer precizitását befolyásoló legnagyobb hátulütő, hogy a hatékony alkalmazhatóság érdekében ki kell iktatni a módosított törzsekből a sejt fő hibajavító útvonalát. Ez azonban számos, nem kívánt mutáció kialakulásához vezet. Ezt a problémát szeretnénk megoldani egy hőmérséklettel ki-be kapcsolható DNS-hibajavító útvonal létrehozásával. Ez a megoldás jelentősen növelné az egész módszer pontosságát.
2. A mikrobiális antibiotikum rezisztencia kialakulása egy óriási jelentőségű, globális probléma. A rezisztencia kialakulásáért felelős evolúciós mechanizmusok kiderítése kiemelt fontosságú, hiszen a rezisztencia mechanizmusok kialakulásának üteme jelentősen meghaladja az új antibiotikumok kifejlesztésének léptékét. Kutatásainkkal pontosan az antibiotikum rezisztencia kialakulásáért felelős molekuláris mechanizmusokat szeretnénk feltérképezni klinikailag releváns szerekkel szemben. Az első témakörben leírt MAGE metódus és annak optimalizált változata egy fontos eszköz a kezünkben célunk eléréséhez. A technika egyedi lehetőséget nyit több rezisztencia mechanizmus párhuzamos és kombinált vizsgálatára. A kutatások akár az antibiotikum kezelések új klinikai stratégiáihoz is vezethetnek.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média illetve az adófizetők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI számára.

Akár a növényeket vagy állatokat, a mikróbákat is lehet nemesíteni, úgynevezett irányított evolúciós folyamatok segítségével a laboratóriumban előállítható valamilyen előnyös tulajdonságú (pl. gyógyszerészeti-, energetikai-, kémiai ipari felhasználású anyagot termelő) mikróba. Az eljárásnak azonban súlyos korlátai vannak: egyrészt időigényes, másrészt közel sem biztos, hogy a legmegfelelőbb genetikai kombinációk maguktól létrejönnek. Egy újszerű eljárás, az úgynevezett multiplex automatizált genommérnöki technika ezekre a problémákra jelent megoldást. A módszer segítségével egyszerre akár 50 gént is lehet specifikusan módosítani pár óra alatt, a rengeteg létrejövő kombináció közül pedig ki lehet válogatni a legmegfelelőbb tulajdonságút. A módszernek azonban van egy súlyos hátulütője: nem elég precíz, vagyis a kívánt módosításokon kívül számos nem kívánt módosulás is létrejön a genetikai állományban. Erre a problémára keressük a megoldást. Az általunk elvégzett optimalizálások segítségével a módszer pontossága jelentősen fokozható, így még hatékonyabb és gyorsabb lesz a „nemesítés”. A tökéletesített genetikai szerkesztő módszer segítségével elsősorban a baktériumok antibiotikumokkal szembeni ellenállását tanulmányozzuk. Napjaink egyik legnagyobb közegészségügyi problémája a fertőző baktériumok és azok ellenállása az antibiotikumokkal szemben. A különböző szerekhez való alkalmazkodás során a baktériumokban genetikai mutációk jönnek létre, melyek lehetővé teszik az ellenállást. A genommérnöki módszer segítségével a kérdéses mutációk létrehozhatók és kombinálhatók, így klinikailag fontos információkat nyerünk az antibiotikumokkal szembeni ellenállás pontos mechanizmusairól.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

The last few years has seen several major advances made in the development of bacterial genome engineering techniques. The most notable of these is multiplex automated genome engineering (MAGE), developed in 2009 by George Church and colleagues at Harvard. The method allows the simultaneous modification of up to 50 selected genomic loci producing unrivaled combinatorial genomic diversity. MAGE is considered to be a major breakthrough in synthetic biology, it has the ability to dramatically accelerate genome editing and analysis. We have recently started implementing MAGE in our laboratory, for the ability to modify genomes at a faster and more precise rate. We have successfully integrated MAGE in our studies concerning the evolution of antibiotic resistance in bacteria. With this approach, any kind of mutation responsible for the adaptation to an antibiotic can be easily generated and combined with others, giving us a powerful way of deciphering the molecular mechanisms behind resistance. Using MAGE, we will uncover the mechanisms behind the bacterial adaptation to several clinically relevant antibiotics and the cross-resistance to other antibiotics that often accompany it. In parallel with this ambitious project, we will also try to optimize and perfect the MAGE method itself. A major drawback of the current protocol is that in order to achieve a sufficient level of efficiency, one must work on a mutator background, which leads to the formation of numerous unwanted mutations. By using special thermosensitive alleles of mismatch-repair enzymes, we will be able to turn the mutator phenotype on-off, therefore the number of secondary mutations can be drastically cut.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

Our research will focus on two independent questions that will be later tied together. First, we will work on perfecting and optimizing the multiplex automated genome engineering (MAGE) method. A major deficiency of the current protocol is that in order to achieve a sufficiently high enough level of allelic replacement efficiency, one must use strains defective in their mismatch repair (MMR) machinery. This leads to a significant increase in mutation rate leading to the accumulation of unwanted background mutations that could have an effect on the desired phenotype. In order to circumvent this problem, we will use special, thermosensitive alleles of proteins involved in the MMR pathway. We hypothesize that by using these enzymes, we will be able to turn on and off the MMR apparatus like a switch, therefore the number of secondary mutations can be dramatically cut down, leading to an improvement in the overall precision of the method. With the optimized MAGE method in hand, we will be able to investigate our other field of questions, namely the study of the evolution of antibiotic resistance in bacteria, with greater efficiency. One of the major focuses of our research group is the investigation of the development of bacterial resistance to numerous clinically relevant antibiotics, coupled with the analysis of the sensitivity of these adapted strains to other antibiotics. Using the improved MAGE technique, we will be able to engineer and combine specific mutations responsible for resistance in any non-adapted strain with ease, therefore the molecular mechanisms behind resistance can be uncovered.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

The relevance of the proposal can be defined along the lines of two distinct categories.
1. The multiplex automated genome engineering (MAGE) technique is considered to be a major breakthrough in synthetic biology. Besides having a wide range of potential biotechnological applications, MAGE has the potential to transform other areas of molecular biology by accelerating genome editing and analysis. The method, or a variation of, is already being used in some of the leading scientific institutions of the world, and it is swiftly spreading. The most significant drawback, in regard to the precision of the technique, is that in order to achieve a sufficiently high level of efficiency, one must eliminate the mismatch repair system of the modified strain. This however leads to the formation of several unwanted, background mutations. We wish to solve this problem by developing a temperature regulated switchable mismatch repair pathway. This solution would significantly improve the precision of the whole method.
2. Bacterial antibiotic resistance is a global human health problem of extreme significance. Understanding the evolutionary mechanisms underpinning drug resistance is of critical importance given that the emergence of drug resistance far outpaces the development of new drugs. Our research is focused on elucidating the mechanisms responsible for the development of resistance to a wealth of clinically relevant antibiotics. The MAGE method and its optimized version described above is a tremendous instrument in our hand to answer these questions. The technique is unique in that it allows for the parallel and combinatorial investigation of multiple resistance mechanisms. These works may lead to the development of novel clinical strategies for combating the evolution of drug resistance in bacteria.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NKFI in order to inform decision-makers, media, and the taxpayers.

Just like plants or animals, microbes can also be selectively bred. Through a process called directed evolution, bacteria with advantageous properties (such as an increased ability to produce pharmaceutically, energetically, or chemically important products) can be created. This process however has several limitations: it is time-consuming and it is uncertain whether the most suitable genetic combinations will form by just chance. A novel technique, termed multiplex automated genetic engineering presents a solution to these problems. Using this method, up to 50 different specific genes can be modified at once in a matter of hours and from the scores of combinations generated, the ones with the most advantageous properties can be selected. The method however has a major drawback: it is not precise enough. Besides the targeted modifications, lots of unwanted changes also occur in the genetic material. This is a problem we are looking to solve. By proper optimization, the precision of the method can be dramatically increased therefore the „breeding” process will be faster and more efficient. With our optimized genetic editing tool in hand, we will focus our studies on the resistance of bacteria to antibiotics. One of the most severe public health problems of our day is the resistance of infectious bacteria to antibiotics. When treated with a drug, bacteria have the ability to adapt by generating mutations that result in resistance. With our optimized genome engineering tool, we will be able to generate and combine these mutations with great efficiency, therefore gaining clinically valuable information about the exact mechanisms behind resistance to antibiotics.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
A kutatási projektben egy olyan mikrobiális genomszerkesztő eljárásnak a fejlesztése valósult meg, mely segítségével precízebben, könnyebben, hatékonyabban és rugalmasabban lehet bevinni célzott módosításokat egy kívánt baktérium törzsbe. Az eljárás, melyet pORTMAGE-nek neveztünk el (portabilis, plazmid alapú Multiplex Autómatizált Genommérnökség) ezenkívül lehetővé teszi, hogy az előszeretettel használt általános bakteriális modellorganizmusokon (pl. Escherichia coli) kívül más, kevésbé ismert fajokban is hatékony genommódosításokat tudjunk létrehozni. A módszer alapja, hogy a módosítani kívánt organizmusokon belül a DNS hibajavító enzimek egyikének egy domináns mutátor allélját expresszáltatunk a hőmérséklet megemelésével. A domináns mutátor enzim működésképtelenné teszi a teljes DNS hibajavító rendszert, így a kívánt módosítás (melyet egyes-szálú DNS oligonukleotid formában juttatunk a módosítandó sejtbe) szelekció nélkül is rendkívül nagy (~20 %) hatékonysággal épül be. A kívánt módosítás beépülését követően a mutátor allél expresszióját a hőmérséklet csökkentésével ki tudjuk kapcsolni, így a továbbiakban más, nem kívánt mutáció nem keletkezik a célsejtben. Ez a nagy fokú precizitás lehetővé tette a módszer alkalmazását számos nagy pontosságot igénylő kutatásokban, ahol például egyetlen mutációnak a hatását vizsgáltuk a mikróbák antibiotikum rezisztencia kialakulásában.
kutatási eredmények (angolul)
During the course of the research project, we have successfully developed a microbial gene editing platform that allows the precise, convenient, highly efficient, and flexible generation of desired modifications into the bacterial strain of choice. The technique, dubbed pORTMAGE (portable, plasmid-based Multiplex Automated Genome Engineering) also allows efficient genome editing in microbial organisms less common to the laboratory, not just the usual model organisms (e. g. Escherichia coli). The basis of the method is the temperature-controlled expression of a dominant mutator allele of one of the enzymes of the methyl-directed mismatch repair system within the host strain. The expression of this enzyme inactivates the mismatch repair system of the host organism, allowing for the highly efficient (~20 % without selection) incorporation of the desired modification (carried on a single-strand DNA oligonucletide transformed into the cell) into the host genome. After integration of the desired modification, the lowering of the temperature switches off expression of the dominant mutator allele, therefore no undesired, off-target mutations will accumulate in subsequent work. This level of precision has allowed us to investigate several key questions regarding the role of single mutations in the development of antibiotic resistance of different microbes, issues with clear clinical relevance.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=109572
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
Nyerges, Á.*, Csörgő, B.*, Nagy, I., Latinovics, D., Szamecz, B., Pósfai, G. and Pál, C.: Conditional DNA repair mutants enable highly precise genome engineering., Nucleic Acids Research, 2014
Lázár, V., Nagy, I., Spohn, R., Csörgő, B., Györkei, Á., Nyerges, Á., Horváth, B., Vörös, A., Busa-Fekete, R., Hrtyan, M., Bogos, B., Méhi, O., Fekete, G., Szappanos, B., Kégl, B., Papp, B., Pál, C.: Genome-wide analysis captures the determinants of the antibiotic cross-resistance interaction network., Nature Communications, 2014
Méhi, O., Bogos, B., Csörgő, B., Pál, F., Nyerges, Á., Papp, B. and Pál, C.: Perturbation of Iron Homeostasis Promotes the Evolution of Antibiotic Resistance., Molecular Biology and Evolution, 2014
Notebaart, R.A., Szappanos, B., Kintses, B., Pál, F., Györkei, Á., Bogos, B., Lázár, V., Spohn, R., Csörgő, B., Wagner, A., Ruppin, E., Pál, C., and Papp, B.: Network-level architecture and the evolutionary potential of underground metabolism., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014
Nyerges,Á.*, Csörgő,B.*,#, Nagy,I., Bálint,B., Bihari,P., Lázár,V., Apjok,G., Umenhoffer,K., Bogos,B., Pósfai,G., and Pál, C.#: A highly precise and portable genome engineering method allows comparison of mutational effects across bacterial species., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016
Szappanos,B.*, Fritzemeier,J.*, Csörgő,B.*, Lázár,V., Lu,X., Fekete,G., Bálint,B., Herczeg,R., Nagy,I., Notebaart,R.A., Lercher, M., Pál, C., Papp, B.: Adaptive evolution of complex innovations through stepwise metabolic niche expansion., Nature Communications, 2016
Csörgő,B., Nyerges,Á., Pósfai,G. and Fehér,T.: System-level genome editing in microbes., Current Opinion in Microbiology, 2016




vissza »