A genomi transzpozonszám-növekedés evolúciós korlátai Escherichia coli-ban, és ennek biotechnológiai vonatkozásai  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »
 

Projekt adatai

  
azonosító
119298
típus K
Vezető kutató Fehér Tamás
magyar cím A genomi transzpozonszám-növekedés evolúciós korlátai Escherichia coli-ban, és ennek biotechnológiai vonatkozásai
Angol cím The evolutionary limits of genomic transposon expansion in Escherichia coli, and its biotechnological implications
magyar kulcsszavak inszerciós szekvencia, prokarióta genom, anyagcseremérnökség, genommódosítás, géncsendesítés
angol kulcsszavak insertion sequence, prokaryotic genome, metabolic engineering, genome editing, gene silencing
megadott besorolás
Általános biokémia és anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)40 %
Genomika, összehasonlító genomika, funkcionális genomika (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)40 %
Mikrobiológia: virológia, bakteriológia, parazitológia, mikológia (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)20 %
zsűri Genetika, Genomika, Bioinformatika és Rendszerbiológia
Kutatóhely Biokémiai Intézet (HUN-REN Szegedi Biológiai Kutatóközpont)
résztvevők Ajibola Walliyulahi
Dev Ranti
Nyerges Ákos
projekt kezdete 2016-10-01
projekt vége 2021-09-30
aktuális összeg (MFt) 40.542
FTE (kutatóév egyenérték) 4.50
állapot aktív projekt





 

Zárójelentés

  
kutatási eredmények (magyarul)
Sikeresen gátoltuk bakteriális inszerciós szekvenciák (IS-ek) mobilitását. A CRISPR/dCas9 ribonukleoprotein-komplexet négy IS-típus (IS1, IS3, IS5, IS150) bal végálló ismétlődéséhez irányítottuk Escherichia coli sejtekben, és azok ugrási gyakorisága drámaian lecsökkent. Ennek hozadéka, hogy a sejtek mutációs rátája szignifikánsan alacsonyabb lett, két kromoszómális és egy plazmid-alapú mutációs teszttel is igazolva. Az ilyen sejtek teljes mRNS-ét megszekvenálva megállapítottuk, hogy az eljárásunk erősen specifikus az IS elemekre, elhanyagolható járulékos transzkripcióváltozást váltva csak ki egyéb lókuszokon. Bizonyítottuk, hogy a bakteriális IS-ek jól használhatók transzgének és akár ötgénes operonok genomi integrációja során mint homológ rekombinációs célpontok. A rekombinációt a CRISPR/Cas9 rendszerrel támogatva akár két kópiában is beültethetőek voltak a transzgének egyetlen lépésben, illetve nem-szelektálható gének (pl. gfp) integrációja is lehetővé vált. Ezek után expresszáltuk a módosított IS-ek transzpozázát az adott gazdasejtben, és szelektáltunk az adott IS-ek kópiaszám-növekedésére. Igy akár 13 kópiáig felsokszorozódott a kromoszómán az általunk beültetett ötgénes operon, amit teljes genom-szekvenálással is igazoltunk. Végül kimutattuk a kromoszómáról történő transzgén expresszió nagyobb stabilitását a plazmidról történő expresszióhoz képest, antibiotikum-szelekció hiányában.
kutatási eredmények (angolul)
Downregulating the mobility of bacterial insertion sequence elements (IS elements) using CRISPR-interference was successfully demonstrated. The CRISPR/dCas9 system was directed to the left inverted repeat (IR) of four IS types (IS1, IS3, IS5, IS150). As a result, the transposition of these IS elements dramatically decreased, significantly reducing the overall mutation rate of Escherichia coli cells measured at two chromosomal loci and one plasmid-based locus. Genome-scale mRNA sequencing revealed that the binding of the CRISPR/dCas9 complex to the IS elements is very specific, with negligible off-target effects on transcription. We have successfully displayed the use of IS elements as landing pads for transgene integration into the bacterial genome using homologous recombination. Facilitating the process with CRISPR/Cas9 cleavage of the targeted ISes permitted the integration of two copies of the transgene at two loci in a single step, as well as the insertion of an unselectable gene (gfp) into the genome. We also to integrated a >9kbp-long, five-gene operon into the chromosome, in one or two copies. Next, we overexpressed the transposase enzyme of the loaded IS, and selected for its copy-number amplification. We obtained up to 13 chromosomal copies of the 5-gene operon this way, verified by whole genome sequencing. Finally, we demonstrated the superior stability of chromosomal gene expression compared to the plasmid-based alternative in the lack of antibiotic selection.
a zárójelentés teljes szövege https://otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=119298
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

  
Ranti Dev Shukla, Ágnes Zvara, Ákos Avramucz, Alyona Biketova, Ákos Nyerges, László G. Puskás, Tamás Fehér: inPOSE: a flexible toolbox for chromosomal cloning and amplification of bacterial transgenes, BioRxiv MS ID: BIORXIV/2021/466346, 2021
Jelena Brkljacic, Bettina Wittler, Benson English Lindsey III, Veena Devi Ganeshan, Michael G. Sovic, Jason Niehaus, Walliyulahi Ajibola, Susanna M Bachle, Tamás Fehér*, David E. Somers*: Frequency, composition and mobility of Escherichia coli-derived transposable elements in holdings of plasmid repositories, Microbial Biotechnology, DOI: 10.1111/1751-7915.13962 (elfogadott cikk), 2021
Avramucz Akos, Moller-Olsen Christian, Grigonyte Aurelija M., Paramalingam Yanahan, Millard Andrew, Sagona Antonia P., Feher Tamas: Analysing Parallel Strategies to Alter the Host Specificity of Bacteriophage T7, BIOLOGY-BASEL 10: (6) 556, 2021
Széll Noémi, Fehér Tamás*, Maróti Zoltán, Kalmár Tibor, Latinovics Dóra, Nagy István, Orosz Zsuzsanna Z., Janáky Márta, Facskó Andrea, Sohajda Zoltán*: Myopia-26, the female-limited form of early-onset high myopia, occurring in a European family, ORPHANET JOURNAL OF RARE DISEASES 16: (1) 45, 2021
Ajibola Walliyulahi, Karcagi Ildiko, Somlyai Gabor, Somlyai Ildiko, Feher Tamas: Deuterium-depletion has no significant impact on the mutation rate of Escherichia coli, deuterium abundance therefore has a probabilistic, not deterministic effect on spontaneous mutagenesis, PLOS ONE 16: (3) e0243517, 2021
Nyerges Á., Bálint B., Cseklye J., Nagy I., Pál C., Fehér T.: CRISPR-interference-based modulation of mobile genetic elements in bacteria, Synthetic Biology (Oxf.), 4(1):ysz008, 2019
Kirtania Prithwiraj, Hódi Barbara, Mallick Ivy, Vass István Zoltan, Fehér Tamás, Vass Imre, Kós Peter B: A single plasmid based CRISPR interference in Synechocystis 6803 - A proof of concept., PLOS ONE 14: (11) e0225375, 2019
Ákos Nyerges, Balázs Bálint, Judit Cseklye, István Nagy, Csaba Pál and Tamás Fehér: CRISPR-based modulation of bacterial genome stability, CRISPRing – A New Beginning for the Genetic Improvement of Plants and Microbes (3-5 September 2018, Budapest, Hungary), 2018
Ranti Dev Shukla, Walliyulahi Ajibola, Ákos Avramucz, Ákos Nyerges, Tamás Fehér: Insertion sequence-mediated engineering of the Escherichia coli genome, Straub-days, (Szeged, Hungary, 10-11 May, 2018), 2018
Ranti Dev Shukla, Walliyulahi Ajibola, Ákos Avramucz, Ákos Nyerges, Tamás Fehér: Multi-copy transgene integration into the Escherichia coli chromosome for metabolic engineering, 5th International Synthetic & Systems Biology Summer School (Siena, Italy, 25-29 July, 2018), 2018
Nyerges Á., Bálint B., Cseklye J., Nagy I., Pál C., Fehér T.: CRISPR-interference-based modulation of mobile genetic elements in bacteria, Synthetic Biology (Oxf.), 4(1):ysz008, 2019
Christian Møller-Olsen, Siu Fung Stanley Ho, Ranti Dev Shukla, Tamas Feher, Antonia P. Sagona: Engineered K1F bacteriophages kill intracellular Escherichia coli K1 in human epithelial cells, Scientific Reports volume 8, Article number: 17559, 2018
Ranti Dev Shukla, Walliyulahi Ajibola, Ákos Avramucz, Ákos Nyerges, Tamás Fehér: Insertion sequence-mediated engineering of the Escherichia coli genome, Straub-days, (Szeged, Hungary, 10-11 May, 2018), 2018
Ranti Dev Shukla, Walliyulahi Ajibola, Ákos Avramucz, Ákos Nyerges, Tamás Fehér: Multi-copy transgene integration into the Escherichia coli chromosome for metabolic engineering, 5th International Synthetic & Systems Biology Summer School (Siena, Italy, 25-29 July, 2018), 2018




 

Projekt eseményei

  
2020-09-28 16:40:41
Résztvevők változása



vissza »