Az alternatív makrofágpolarizáció transzkripciós faktor kaszkádjainak genomszintű vizsgálata újgenerációs szekvenálási eljárások integrációjával  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
124843
típus PD
Vezető kutató Nagy Gergely
magyar cím Az alternatív makrofágpolarizáció transzkripciós faktor kaszkádjainak genomszintű vizsgálata újgenerációs szekvenálási eljárások integrációjával
Angol cím Highly integrated genome level examination of transcription factor cascades during alternative macrophage polarization using next-generation sequencing methods
magyar kulcsszavak makrofágpolarizáció, transzkripciós faktor kaszkád, funkcionális genomika
angol kulcsszavak macrophage polarization, transcription factor cascade, functional genomics
megadott besorolás
Bioinformatika (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)80 %
Epigenetika és génszabályozás (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)10 %
Molekuláris Biológia (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)10 %
Ortelius tudományág: Molekuláris biológia
zsűri Sejt- és Fejlődésbiológia
Kutatóhely ÁOK Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet (Debreceni Egyetem)
résztvevők Nagy László
projekt kezdete 2017-12-01
projekt vége 2020-11-30
aktuális összeg (MFt) 15.219
FTE (kutatóév egyenérték) 2.40
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

Kutatócsoportunk különböző makrofágok génszabályozását vizsgálja újgenerációs szekvenálási (NGS) eljárások, mint ATAC-seq, ChIP-seq, GRO-seq és RNA-seq alkalmazásával. A ChIP-seq (és közvetve az ATAC-seq is) lehetővé teszi a kromatin fehérjék, pl. a transzkripciós faktorok (TF-ok) DNS-kötésének teljes genom-szintű megfigyelését; a gének átírását vizsgáló NGS (GRO-seq és RNA-seq) módszerek felhasználásával pedig az is meghatározható, hogy az egyes kötőhelyek melyik géneket szabályozzák. Korábban megmutattuk, hogy az RXR hogyan járul hozzá az egér csontvelő eredetű makrofágok génszabályozásához. A jelen projektben az IL-4 kezelt, alternatívan polarizált makrofágok kialakulását és az RXR ebben betöltött szerepét szeretnénk megvizsgálni. Célunk annak a kiderítése, hogy a STAT6-ot követően melyik TF-ok járulnak hozzá ehhez a differenciációhoz. Ismert például, hogy az EGR2 részt vesz az alternatív polarizációban, és legújabb eredményeink szerint a PPARg:RXR heterodimer is szerepet játszik a folyamatban. Az egérből származó adatok mellett rendelkezésünkre állnak IL-4 kezelt humán monocita eredetű makrofágokból származó NGS adatok is. A humán és egér adatok együttes használata páratlan lehetőséget nyújt a génszabályozás fajok közötti összehasonlítására és az evolúciós megőrzöttség meghatározására. Az in vitro modellek mellett szeretnénk kiterjeszteni a tanulmányt az in vivo vázizom „javító” makrofágokra is. Úgy gondoljuk, hogy az alternatív polarizációt és az izomgyógyulást szabályozó TF-ok és cisztrómjaik kölcsönhatásainak és dinamikájának megértése általános érvényű szabályszerűségeket nyújthat a nagy ütemben fejlődő funkcionális genomika kutatóinak számára.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

A makrofágokat meghatározó fő TF-ok a PU.1, IRF8, C/EBP és az AP-1, de ezek mellett a szöveti környezettől függően további TF-ok is jelentős szereppel bírhatnak a génszabályozásban. Bizonyos stimulusok (pl. IL-4 vagy izomsérülés) hatására a makrofágok differenciáción mennek keresztül. Az átfogó hipotézisünk az, hogy ezeket a változásokat TF kaszkádok okozzák, amelyek a korábbi cisztrómokra épülve, azokkal együttműködve és azokat kiterjesztve, új szabályozó hálózatokat alakítanak ki, amelyek végül átprogramozzák a sejtet. IL-4 jelenlétének hatására a STAT6 DNS-kötése új TF-ok kifejeződését segíti elő, amelyek ismét más TF-okat serkenthetnek. Ebben a folyamatban vesz részt az EGR2 és a PPARg is, de pontos szerepük nem ismert. Célunk e TF-ok az alternatív polarizációban betöltött szerepének vizsgálata, vad típusú, Egr2 és Pparg KO sejtekből származó NGS adatok alapján; és arra is választ szeretnénk kapni, hogy a PPARg vajon ligandfüggő módon működik-e. A folyamat feltételezhetően humán makrofágokban is hasonlóan zajlik le, amit ugyancsak bizonyítani szeretnénk. Adataink tehát a humán és egér cisztrómok összehasonlítását is lehetővé teszik, amely az érintett gének szabályozásának evolúciójáról is árulkodhat. Korábban leírtuk, hogy a PPARg az izomregenerációban résztvevő makrofágok szabályozásában is szerepet játszik. A legújabb ATAC-seq adataink lehetővé teszik a regeneráció során izolált makrofágok összes szabályozó régiójának feltérképezését. Ezzel az adathalmazzal képesek leszünk a nyitódó és záródó kromatinrégiók meghatározására, melyek DNS elemei felfedik az ezeken működő, tehát végsősoron a változásokért felelős TF-okat.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

Az alternatívan polarizált vagy gyulladásgátló makrofágok az endocitikus funkción felül számos szabályozó szereppel bírnak: részt vesznek az immunszabályozásban, a szövetátépítésben és az érképzésben, amelyek akár tumorképződéshez is vezethetnek. A különböző szövetekben való viszonylag kis sűrűségük ellenére sérülést vagy fertőzést követően ezek a funkciók kulcsszereplőkké teszik a makrofágokat. Hogy megértük a szerepüket, humán és egér in vitro modelleket alkalmazunk, és van egy egér in vivo izomregenerációs modellünk is. A genomi hatásmechanizmusok vizsgálatára a génszabályozó folyamatokat felfedő NGS módszereket alkalmaztunk. Az ATAC-seq az egyik legújabb NGS módszer, amely megmutatja a nem hisztonfehérjék, hanem TF-ok és koregulátoraik által kötött genomi régiókat. A referencia annotációt és a CTCF elemeket felhasználva elkülöníthetjük a promóterközeli és attól távoli szabályozó régiókat, valamint az inzulátorokat, amely lehetővé teszi az adott sejtpopuláció génszabályozásához hozzájáruló legfőbb TF-ok megjóslását. Ez a módszer kevésbé elfogult, mint a ChIP-seq, amely egy kiválasztott fehérje genomi eloszlására összpontosít, de hasonlóan erős motívumfeldúsulásokat ad. Ezek a feldúsulások kijelölik a TF családokat és néha az adott TF-t is, amely(ek) kötheti(k) a motívumokat. Az ATAC-seq akár egy sejten is alkalmazható, így alkalmas olyan kis sejtpopulációk feldolgozására, mint amilyenek egér izomból is kinyerhetőek. Magyarországon mi használtuk először ezt a módszert, de világszerte is csak ~50 olyan labor van, amely képes volt cikket közölni ATAC-seq adatok alapján, és csak ~150 olyan projekt van, amelynek mintáit közzétették az SRA adatbázisban. Fontos megjegyezni azonban, hogy ezek több mint 6000 mintát foglalnak magukban, jelezve a terület erőteljes fejlődését. Mi használunk először kromatinhozzáférhetőségi adatokat makrofágok differenciációs szignálokra adott cisztrómikus válaszainak a követésére. Jövőbeli eredményeink betekintést nyújthatnak az alternatív polarizáció molekuláris mechanizmusába és rámutathatnak a kulcs TF-okra, amelyek meghatározzák a folyamatot. Ezek az eredmények terápiás célpontokat biztosítva segíthetnek számos betegség, pl. fertőzések és tumorok gyógyításában.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.

Kutatócsoportunk a makrofágokat, az egyik leginkább központi immunsejteket vizsgálja. Attól függően, hogy melyik szervben vagy szövetben találhatóak, a makrofágok nagyon változatosak. Fő szerepük a haldokló sejtek, a szöveti törmelékek és a kórokozók eltakarítása, de részt vesznek a szövetek kijavításában és a akár daganatok kialakulásában is. Kutatócsoportunk a humán és egér makrofágok génszabályozását vizsgálja. Ehhez az egyik legújabb molekuláris biológiai technikát, az újgenerációs szekvenálást (NGS-t) használjuk. Az NGS-t használó módszerek egy része lehetővé teszi a különböző fehérjék DNS-kötésének megfigyelését, míg más NGS módszerek használatával az is meghatározható, hogy ezek által melyik gének szabályozottak. Ebben a projektben a javító típusú makrofágok fejlődését szeretnénk megvizsgálni. Célunk, hogy megtaláljuk, melyik fehérjék, és hogyan járulnak hozzá ehhez a folyamathoz. Korábban azt találtuk, hogy a PPARg szabályozza mind a humán, mind az egér javító makrofágokat, de a hatásmechanizmus nem ismert pontosan. A PPARg egy zsírsavérzékelő fehérje, amely képes a DNS-hez kötődni, és így szabályozza a géneket, de az nem világos, hogy a rá specifikus jelmolekulák hiányában is képes-e DNS-t kötni. A humán és egér adatok együttes használata páratlan lehetőséget nyújt a különböző fehérjék általi génszabályozás fajok közötti összehasonlítására. Úgy gondoljuk, hogy e fehérjék dinamikusan változó kölcsönhatásainak a megértése általános érvényű szabályszerűségeket nyújthat a kutatóknak, majd később az orvosoknak, hogy hatékonyabban kezelhessék az olyan betegségeket, amelyekben makrofágok is részt vesznek.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

Our research group has been examining the gene regulation of different macrophages by applying next-generation sequencing (NGS) methods such as ATAC-seq, ChIP-seq, GRO-seq and RNA-seq. ChIP-seq (and indirectly also ATAC-seq) allow(s) the whole genome-level observation of the DNA-binding of chromatin proteins e.g. transcription factors (TFs); and with the use of NGS methods examining gene transcription (GRO-seq and RNA-seq) it can also be determined which genes are regulated by the individual binding sites. Previously we have shown how RXR contributes to the gene regulation of mouse bone marrow-derived macrophages. In this project we would like to examine the development of IL-4 treated, alternatively polarized macrophages and the role of RXR in this process. Our goal is to find out that following STAT6, which TFs contribute to this differentiation. It is known that EGR2 participates in alternative polarization, and according to our newest results the PPARg:RXR heterodimer also plays a role in this process. Beside the mouse-derived data we have NGS data from IL-4-treated human monocyte-derived macrophages too. The combined use of human and mouse data provides a unique opportunity for the interspecies comparison of gene regulation to determine evolutionary conservation. Beside the in vitro models we are proposing to extend our studies to in vivo skeletal muscle repair macrophages. We think that the understanding of the interactions and dynamics of TFs and their cistromes regulating alternative polarization and muscle healing might provide general regularities for the researchers of the rapidly developing functional genomics.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

The major TFs determining macrophages are PU.1, IRF8, C/EBP and AP-1, but beside these, depending on the tissue environment, further TFs might play significant roles in gene regulation. As a consequence of certain stimuli (e.g. the presence of IL-4 or muscle damage) macrophages go through a differentiation. Our overarching hypothesis is that these changes are caused by TF cascades, which, building on the pre-established cistromes, working together with and expanding those, form new regulatory networks, which ultimately reprogram the cell. As a result of IL-4 exposure, the DNA-binding of STAT6 induces the expression of new TFs, which might also induce further TFs. EGR2 and PPARg participate in this process, but their exact role is unknown. Our goal is to examine their role in alternative macrophage polarization based on NGS data derived from wild type, Egr2, Rxr and Pparg KO cells; and we would like to get an answer whether PPARg acts in a ligand-dependent manner. Presumably this process takes place similarly in human macrophages, which we also want to prove. Our data thus make possible the comparison of human and mouse cistromes, which may reveal the evolutionary conservation of the involved genes’ regulation. Previously we described that PPARg plays a role in the regulation of macrophages participating in muscle regeneration. Our newest ATAC-seq data make possible to map all the regulatory regions of the macrophages isolated during the regeneration. By this data set we will be able to locate the opening and closing chromatin regions, of which DNA elements reveal those TFs acting through these sites and thus are ultimately responsible for the changes.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

Alternatively polarized or anti-inflammatory macrophages have several regulatory roles beyond their endocytic functions: they participate in immunoregulation, tissue remodeling and angiogenesis, which might even lead to tumor promotion. Despite their relatively low density in the different tissues, these functions make macrophages central players upon injury or infection. To understand their role we apply in vitro models from human and mouse, and we also have an in vivo muscle regeneration model from mice. To investigate the mode of genomic actions we applied NGS methods uncovering gene regulatory processes. ATAC-seq is one of the newest NGS methods showing those genomic regions, which are not covered by histone proteins but instead TFs and their co-regulators. Using the reference annotation and the CTCF elements, we can distinguish the promoter-proximal and promoter-distal regulatory regions, as well as the insulators, which let us predict the major TFs contributing to gene regulation in the given cell population. This method is less biased than a ChIP-seq, which concentrates on the genomic distribution of one chosen protein, but gives similarly strong motif enrichments. These motif enrichments are good indicators of the TF families and sometimes the given TF that is/are able to bind the motifs. ATAC-seq can be applied even on single-cells, thus it is suitable for the processing of as small cell populations as those sorted from mouse muscles. In Hungary we first introduced this method but there are only ~50 laboratories worldwide, which were able to publish articles based on ATAC-seq data, and there are still only ~150 projects of which samples are published in the SRA database. Although it is important to note that these include more than 6000 samples representing the dynamic development of the field. We first use chromatin accessibility data to follow the cistromic responses of macrophages to differentiation signals. Our future results will give insight the molecular mechanism of alternative polarization and will appoint to the key TFs determining the process. These results by providing therapeutic targets might help to cure several pathological processes, such as infections or tumor progression.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.

Our research group examines macrophages, one of the most central immune cells. Macrophages are very varied depending on the organ or tissue in which they can be found. Their main role is the clearance of dying cells, tissue debris and pathogens, but they participate also in tissue reparation or even tumor progression. Our research group examines the gene regulation of human and mouse macrophages. For this we use one of the newest molecular biology techniques called next-generation sequencing (NGS). Some of the methods using NGS allow the observation of the DNA-binding of different proteins, while with the use of other NGS methods it can also be determined which genes are regulated by these. In this project we would like to examine the development of repair type macrophages. Our goal is to find which proteins and how they contribute to this process. We found previously that both human and mouse repair macrophages are regulated by PPARg, but the mode of action is not well understood. PPARg is a fatty acid sensor, which is able to bind to DNA and thus regulate genes, but it is not clear whether it is able to bind to DNA in the lack of its specific signal molecules. The combined use of human and mouse data provides a unique opportunity for the interspecies comparison of gene regulation by the different proteins. We think that the understanding of the dynamically changing interactions of these proteins might provide general regularities for the researchers and later for the physicians to treat more efficiently those diseases, which macrophages are also involved in.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
Vizsgálataink során felépítettük az alternatívan polarizált makrofágokat vezérlő transzkripciós faktor (TF) kaszkád gerincét. Egér KO modelleket felhasználva megerősítettük, hogy az interleukin-4 (IL-4) indukálta STAT6 aktiváció egyéb TF-ok mellett az EGR2-t is bekapcsolja, amely hozzájárul a PPARγ indukciójához. Megmutattuk továbbá, hogy az ezen TF-ok általi DNS kötés a kromatin nyitásával és ko-regulátorok és Pol II feldúsulással is párosul. A folyamat során megnövekedett PPARγ/RXR cisztróm nagy része ligandfüggetlennek adódott, és érdekes módon az IL-4-gyel történő restimuláció bekapcsolt egy olyan PPARγ-függő géncsoportot, melyet a makrofág modellünkben korábban nem láttunk. A PPARγ cisztróm ligandfüggő részében megfigyeltük a PPAR/RXR kiterjesztett felismerő szekvenciáját (PPRE), és megerősítettük, hogy a PPRE-k 5’ kiterjesztése jelentős szereppel bír a DNS-fehérje kölcsönhatásokban. Eredményeink felhívták a figyelmet a sejttípusokat meghatározó és szignálfüggő TF-okkal való együttes DNS kötés, valamint a gyenge félhelyek (a dimerkötő helyeken belüli gyenge monomer kötőhelyek) jelentőségére, amely bármely TF dimer kötőhelyeire általánosan jellemző lehet. A regenerálódó egér vázizomból származó makrofágok vizsgálata során a BACH1-et a gyulladásos makrofágokból a helyreállító fenotípusra való átállás egyik kulcs szereplőjeként azonosítottuk. BACH1 hiányában sérült a regeneráció folyamata, felhívva ezzel a figyelmet e TF és a makrofágok fontosságára az izomgyógyulásban.
kutatási eredmények (angolul)
During our investigations, we built up the regulatory axis of the transcription factor (TF) cascade driving the alternative polarization of macrophages. By using mouse KO models, we verified that the interleukin-4 (IL-4)-induced STAT6 activation, among other TFs, turns on EGR2, which contributes to the induction of PPARγ. Furthermore, the DNA binding of these TFs is accompanied by chromatin opening and the recruitment of co-regulators and Pol II. Most of the extended PPARγ/RXR cistrome appear to be ligand-insensitive, and interestingly, the re-stimulation by IL-4 turns on a PPARγ-dependent gene set, which has been invisible in our macrophage model before. In the ligand-dependent part of the PPARγ cistrome, we observed an extended recognition sequence of PPAR/RXR (PPRE), and we verified that the 5’ extension of PPREs have a significant role in DNA-protein interactions. Our results also drew attention to the significance of collaborative DNA binding with lineage-determining and signal-dependent TFs and weak half-sites (weak monomer binding sites within dimer binding sites), which appears to be a general phenomenon for the binding sites of any TF dimers. During the examination of macrophages derived from regenerating mouse skeletal muscle, we identified BACH1 as a major player in the phenotype switch from inflammatory to repair macrophages. The lack of BACH1 resulted in impaired regeneration, highlighting the importance of this TF and the macrophages in this process.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=124843
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
Dániel Bence, Nagy Gergely, Czimmerer Zsolt, Horváth Attila, David W. Hammers, Ixchelt Cuaranta-Monroy, Póliska Szilárd, Petros Tzerpos, Kolostyák Zsuzsanna, Tristan T. Hays, Andreas Patsalos, René Houtman, Sascha Sauer, Jean Francois-Deleuze, Fraydoon Rastinejad, Bálint Bálint László, H. Lee Sweeney, Nagy László: The Nuclear Receptor PPARg Controls Progressive Macrophage Polarization as a Ligand-Insensitive Epigenomic Ratchet of Transcriptional Memory, Immunity, 2018
Dániel Bence, Nagy Gergely, Horváth Attila, Czimmerer Zsolt, Ixchelt Cuaranta-Monroy, Póliska Szilárd, Tristan T. Hays, Sascha Sauer, Jean Francois-Deleuze, Nagy László: The IL-4/STAT6/PPARg signaling axis is driving the expansion of the RXR heterodimer cistrome, providing complex ligand responsiveness in macrophages, Nucleic Acids Research, 2018
Andreas Patsalos, Petros Tzerpos, Halász László, Nagy Gergely, Pap Attila, Nikolas Giannakis, Konstantina Lyroni, Vasiliki Koliaraki, Pintye Éva, Dezső Balázs, George Kollias, Charalampos G. Spilianakis, Nagy László: The BACH1–HMOX1 Regulatory Axis Is Indispensable for Proper Macrophage Subtype Specification and Skeletal Muscle Regeneration, The Journal of Immunology, 2019
Nagy Gergely, Dániel Bence, Ixchelt Cuaranta-Monroy, Nagy László: Unraveling the Hierarchy of cis and trans Factors That Determine the DNA Binding by Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ, Molecular and Cellular Biology, 2020
Nagy Gergely, Nagy László: Motif grammar: The basis of the language of gene expression, Computational and Structural Biotechnology Journal, 2020
Dániel Bence, Czimmerer Zsolt, Halász László, Botó Pál, Kolostyák Zsuzsanna, Póliska Szilárd, Wilhelm K Berger, Petros Tzerpos, Nagy Gergely, Horváth Attila, Hajas György, Cseh Tímea, Nagy Anikó, Sascha Sauer, Jean Francois-Deleuze, Szatmári István, Bácsi Attila, Nagy László: The transcription factor EGR2 is the molecular linchpin connecting STAT6 activation to the late, stable epigenomic program of alternative macrophage polarization, Genes & Development, 2020
Csumita Mária, Csermely Attila, Horváth Attila, Nagy Gergely, Monori Fanny, Göczi Loránd, Hans-Acha Orbea, Walter Reith, Széles Lajos: Specific enhancer selection by IRF3, IRF5 and IRF9 is determined by ISRE half-sites, 5′ and 3′ flanking bases, collaborating transcription factors and the chromatin environment in a combinatorial fashion, Nucleic Acids Research, 2020
Bojcsuk Dóra, Nagy Gergely, Bálint Bálint László: Alternatively Constructed Estrogen Receptor Alpha-Driven Super-Enhancers Result in Similar Gene Expression in Breast and Endometrial Cell Lines, International Journal of Molecular Sciences, 2020




vissza »