Axonális feszültségjelek mérése kisméretű moharost terminálisokban közvetlen elvezetés és imaging módszerekkel  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
125148
típus K
Vezető kutató Szabadics János
magyar cím Axonális feszültségjelek mérése kisméretű moharost terminálisokban közvetlen elvezetés és imaging módszerekkel
Angol cím Direct recording and imaging of axonal voltage signals in small mossy fiber terminals
magyar kulcsszavak Hippocampus, akciós potenciálok, moharost axon, patch clamp elektrofiziológia, nagy és kicsi moharost terminálisok
angol kulcsszavak Hippocampus, action potentials, Mossy fibers, patch clamp electrophysiology, large and small mossy fiber terminals
megadott besorolás
Neuroanatómia és idegélettan (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)100 %
zsűri Idegtudományok
Kutatóhely Lendület Celluláris Neurofarmakológia (HUN-REN Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet)
résztvevők Brunner János
projekt kezdete 2017-12-01
projekt vége 2018-03-31
aktuális összeg (MFt) 12.435
FTE (kutatóév egyenérték) 0.34
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

Az axonok közvetítik az akció potenciálokat a szinapszisokig, ahol ezek a digitális jelek analóg posztszinaptikus válaszokká alakulnak át a követő sejtek ezreiben. Annak ellenére, hogy az idegi működések közel felét ez a digitális analóg jel-átalakítás jelenti az agyban, a szabályai mégsem ismertek megfelelőképpen. Az axonokkal kapcsolatos ismereteink nagy része atipikus morfológiájú terminálisok vizsgálatán alapul, azok méretükből adódó könnyebb vizsgálhatósága miatt, mint például a gyrus dentatus szemcsesejtektől eredő szokatlanul nagy moharost axon terminálisok (GMFT). Az agyi szinapszisok többségét adó kisméretű axonokat eddig nem lehetett vizsgálni hasonló részletességű elektrofiziológiai mérésekkel. Ahogy előzetes kísérleteink bizonyítják, mára már hozzáférünk a szinapszisok többségéhez hasonló, kisméretű moharost axon terminálisokhoz (sMFT) is és mind patch clamp, mind új képalkotási eljárásokkal közvetlenül vizsgáljuk az axon működését ezekben az átlagos méretű szinapszisokban is. Fontos szempont, hogy mivel a sMFT-k és GMFT-k azonos axonokon részei, összehasonlításuk révén megtudjuk, hogy méret-függő axonális mechanizmusok hozzájárulnak-e azok egyedi fiziológiai feladataikhoz és, hogy az axonális jelfeldolgozás hasonló alapvető szabályokat követ-e a kis méretű axonokban, mint a szokatlanul nagy társaikban. E célért, megmérjük a sMFT-k aktív és passzív membrán tulajdonságait és összevetjük azokat a GMFT-k jól ismert a sajátságaival. Az eredményeink fontosak az sMFT-k a hippokampális működésben betöltött egyedi szerepének megértéséhez is. Tehát ez a pályázat egyedülálló betekintést nyújt mind az axonális működés alapvető szabályaiba, mind a hippokampusz működésébe.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

Mivel az axonok az idegrendszer legalapvetőbb elemei köze tartoznak, a működéseik ismerete elengedhetetlen ahhoz, hogy idővel megértsük azt, hogy az idegsejt-hálózatok, hogy hozzák létre a tudatos és egyéb idegrendszeri működéseinket. Ebben a pályázatban az ún. moharostok megértése a célunk, amelyek a gyrus dentatus principális sejtjeinek, a szemcsesejteknek az axonjai. Bár korábban az axonokat egyszerű közvetítőknek tekintettük, nagy axon struktúrákból (pl. GMFT) végzett elektrofiziológiai elvezetések a közelmúltban rámutattak arra, hogy az egyes idegsejtek hatását összetett folyamatok szabályozzák az axonjuk szintjén is. Hogy megértsük azt, hogy a szinapszisok többségét jelentő axonok működését is hasonló dinamikus és specifikus szabályok irányítják, kis méretű sMFT-ből végzünk patch clamp elvezetést. A sMFT-ket is ugyanazok az axonok alakítják ki mint a GMFT-ket, de méretük sokkal kisebb, így jobban reprezentálják az agyi szinapszisok döntő többségét és eltérő szerepet is töltenek be a hippokampusz működésében, mint óriási társaik. A közvetlen elektrofiziológia részletességére és feszültség-érzékeny képalkotó módszerek előnyeire támaszkodva, azt a hipotézist vizsgáljuk, hogy az eltérő méretű szinapszisokban eltérő aktív és passzív membrán folyamatok felelősek azok egyedi működéséért. Meghatározzuk az ionáramokat, amelyek az egyedi, de plasztikus akciós potenciál alakért felelősek ezekben a szinapszisokban és azokat is, amelyek összekapcsolják a preszinaptikus aktivitást a szinaptikus válaszokkal. Mivel a kis axon terminálisok működése egy felfedezetlen tudományos terület, gyakorlatilag minden egyes kísérletes megfigyelésünk fontos és teljesen új felfedezést eredményez.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

A pályázat révén az univerzális axonális jelátviteli szabályokba és a hippokampus működésekbe nyert egyedülálló betekintés különleges előnyt teremt a csoportunk számára alapvető idegi funkciók megismeréséhez. A hagyományos elektrofiziológiai vizsgálatok megfelelő részletességgel írták le a szomatikus, dendritikus és a szokatlanul nagy axonális membránok biofizikai jellemzőit, amelyek nélkülözhetetlenek a legbonyolultabb ismert struktúra, az emberi agy működésének megismeréséhez. Az átlagos méretű axon végződések elektrofiziológiai vizsgálata azonban a természetes környezetükben sokkal nehezebb, mivel e kis struktúrák nagysága éppen az ilyen módszerek feloldóképességének határát jelenti. Tovább-fejlesztett elektrofiziológiai eljárások alkalmazásával közvetlen elvezetéseket végezünk ilyen kis axonális struktúrákból, konkrétan a hippokampális gyrus dentatus szemcsesejtek apró axon végződéseiből. Nincs tudomásom más kutatócsoportról, ahol hasonló kísérletek zajlanának az axon terminálisok ezen fajtáján, amelyek mérete egybevág az agykérgi szinapszisok többségével. Szintén ideális kísérleti alannyá teszi ezeket a terminálisokat az a tény, hogy ugyanezen az axonon találhatóak jól-ismert óriás axon végződések is, a GMFT-k, és az ezeken korábban végzett elektrofiziológiai kísérletek sok esetben megalapozták az axonális jelátvitelről szóló ismereteinket. Ennek köszönhetően, az eddig ismeretlen kis terminálisok és a már ismert nagy terminálisok alapvető biofizikai tulajdonságait tudjuk feltérképezni hasonló kísérleti körülmények között. Emiatt, új eredményeink közvetlenül összehasonlíthatóak lesznek az eddigi ismeretanyaggal és egy könnyen általánosítható nézőpontból tekintenek rá az alapvető axon működésekre és szabályokra. A fenti alapvető idegtudományi jelentőségeken kívül, eredményeink hozzájárulhatnak olyan betegségekhez kapcsolódó idegi folyamatok megértéséhez, amelyekben szerepet játszik a hippokampusz vagy általános axon működéseket érintenek.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.

Az idegsejtek apró kimeneti nyúlványai, az axonok hajtják végre az idegi jelfeldolgozás jelentős hányadát és több betegség, például az epilepszia és migrén bizonyos formái hátterében is rendellenes axon működés áll. Az axonok fő feladata, hogy az idegsejtek aktivitását a digitális jelként terjedő akciós potenciál formájában nagy távolságra eljuttassák, majd analóg jelekké alakítsák azokat a nagyszámú követő sejteken alkotott szinapszisokban. Azonban az axon végződések többségének apró mérete miatt eddig nem volt lehetséges a megfelelő részletességgel feltárni működésük szabályait. Mai tudásunk javarészt a különösen nagyméretű axon végződéseken végzett kísérleteken alapul. De ezek elektromos működése eltérhet a szokványos szinapszisokétól, éppen a nagy méretükből fakadóan. Különösen fontos lenne megismerni, hogyan terjed a digitális akciós potenciál és fordítódik le analóg szinaptikus jellé. A csoportunk elmúlt években felhalmozott technikai tapasztalataira és a közelmúltban továbbfejlesztett módszerekre támaszkodva mostanra sikerült elérnünk, hogy az agyban általánosan jellemző, apró axon végződések biofizikai működéséről is megfelelő részletességű adatokat gyűjtsük. Ebben a pályázatban, ezzel a módszerrel egy olyan axon pálya működését térképezzük fel, amely rendelkezik mind nagy és kis méretű axon végződéssel. Ezáltal, nem csak eddig ismeretlen, általános axonális működési szabályokat ismerünk meg, hanem azokat közvetlenül összehasonlítjuk a nagy axon terminálisok vizsgálatával szerzett korábbi ismeretekkel. Tehát, munkánk az axon működésekkel kapcsolatos alapvető ismereteket tár fel, amelyek révén jobban megértjük a legbonyolultabb anyagi struktúra, az agyunk működését
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

Axons broadcast action potential activity to synaptic terminals that translate this digital signal to analogue postsynaptic responses in thousands of follower neurons. Albeit this digital/analog conversion constitutes practically half of the primary neuronal computation in the brain, its principles remain elusive. Our knowledge about the axonal signaling comes mostly from studies of axon terminals that have unusual morphology, such as the extremely large mossy fiber terminals (GMFT) of the dentate gyrus granule cells. However, similar insightful direct electrophysiology was not possible for small axons, which constitute the large majority of synapses of the CNS. As our preliminary data demonstrate, now we gain access to single small axon MFTs (sMFT) and directly investigate the properties of axonal signaling principles in these regularly sized axon terminals using patch clamp together with the support of novel imaging methods. Because the sMFTs and GMFTs formed on the same axons, we are able to examine how size-dependent axonal mechanisms contribute to their distinct physiological functions and whether axonal signaling is governed by the same principles in the small axon terminals as in the unusually large axonal structures. For this aim, we will directly compare the better known active and passive membrane properties of the GMFTs with those of the sMFTs. Furthermore, because the synaptic functions of the sMFTs and GMFTs are segregated, our results will be also important for determining the specific contribution of the sMFTs to hippocampal functions. Thus, this proposal will provide unprecedented insights into general axonal signaling principles and hippocampal functions.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

Because axons are one of the most elementary components of the nervous system, the understanding of the principles of their signaling is essential for the basic understanding of how neuronal communication creates cognition and other neural functions. Here we study the axons of the hippocampal granule cells, called mossy fibers, linking the dentate gyrus and CA3 regions. Albeit axons were originally viewed as simple relay devices, recent electrophysiological studies of large axonal structures, such as the GMFT, revealed that the downstream effects of single neurons are regulated at the level their axons by complex mechanisms. To better understand whether similar dynamic and specific principles regulate the axonal and synaptic functions in the majority of terminals that are much smaller, we developed similar patch clamp techniques for the sMFTs. Small MFTs are formed on the same axons as GMFTs, but their size is equivalent of the majority of the cortical synapses and they play distinct roles in the neuronal communication between hippocampal regions. Taking advantage of the details of electrophysiology together with novel voltage-imaging methods, we will test the hypothesis that synapse-size-specific active and passive membrane properties contribute to the functional differences of sMFTs and GMFTs. We will determine the ionic currents that generate their specific spike waveforms and that serve as the functional link between the dynamic presynaptic activity and synaptic responses. Because the signaling principles in small axon terminals is a largely uncharted scientific territory, practically every result of our experiments will represent absolutely new and major discoveries.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

Altogether, this proposal will provide unprecedented insights into the general axonal signaling principles and hippocampal functions and places us in a unique position to answer fundamental questions concerning major neuronal functions. Conventional electrophysiology revealed sufficient details concerning the biophysical properties of somatic, dendritic and unusually large axonal membranes enabling to understand crucial aspects of neuronal information processing within the most elaborate known material structure, the human brain. However, direct electrophysiology of regular sized axon terminals in their native environment, such as in acute slice preparations, has been difficult because such small axon terminals were at the limit of the resolution of this technique. Using an improved electrophysiology we gain direct access to and obtain direct recordings from small axon terminals, specifically from the small axon terminals of the axons of the granule cells of the hippocampal dentate gyrus region. I am not aware of other research groups worldwide where similar experiments are being performed on this type of axon terminal, whose size is equivalent of the majority of the cortical synapses. A further reason, which makes the small mossy axon terminals an ideal subject for this study is that the same axons form a well-known giant axon terminal, from which many of our current fundamental knowledge about axonal signaling originated by direct recordings. Therefore, we are able to obtain essential biophysical details from the unknown small and the known large terminal types of the same axon, under the same experimental conditions. Thus, our findings can be directly related to the previously established knowledge and implicated in a more general perspective concerning the essential functions of most axon terminals. Furthermore, our findings will also help the understanding of neuronal mechanisms that may be related to diseases that either involve the hippocampus or affect axonal signaling in general.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.

The thin extensions of nerve cells, called the axons, perform a major fraction of the neuronal signaling and the malfunctions of axons are involved in several diseases, such as certain forms of epilepsy and migraine. Axons transfer the all-or-none action potential signals to long distances and translate these digital signals to analog responses in the synapses that are formed on a large number of follower neurons. However, our understanding of the axonal functions has several shortcomings mostly because their small size prevented the detailed experimental investigations. The current knowledge about the electrical signaling within axons mostly derives from unusually large axon terminals, whose functions and mechanisms, however, are probably different from those of the majority of the axon terminals in our brain, which are much smaller. Specifically, we have to understand how the digital action potentials are propagated and converted to neurotransmitter release in small axonal endings. Taking advantage of our experiences with recently improved methods enabled my research group to gain insight into the electrical signaling within the small axonal endings at sufficient details, whose size is equivalent to that of the majority of axons of our brain. Using this improved methodology we will examine a type of axon that forms both small and large terminals. Therefore, we are able to determine previously unknown signaling principles in the typical sized axons and directly compare the knowledge that was established in larger axonal endings. Thus, we will contribute to general knowledge concerning the roles of axons in the workings of the most elaborated material structure: our brain





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
A project célja a hippocampalis moharost axon terminálisokban zajló jelfeldolgozási folyamatok jobb megértése, mivel az axonok működését - bár közismerten alapvető szerepűek az idegi jelfeldolgozásban - kevéssé érjük, mivel közvetlen vizsgálatuk technikailag nehéz volt. A projekt azt a konkrét kérdést tette fel, hogyan működnek az akciós potenciálok (AP) az apró méretű moharost terminálisokban (sMFT) a már jobban ismert, de különlegesen nagy méretű moharost terminálisokhoz (GMFT) képest. Ehhez közvetlen patch clamp elektrofiziológiai és feszültség-érzékeny festék imaging módszereket használunk. Azonban az OTKA támogatást idő elött le kellett zárni, mivel a kutatócsoportunk elnyert egy ERC Consolidator grant-ot, amelynek a témája jelentősen átfed. Mindenesetre az OTKA project összes célja meg fog valósulni a másik támogatásból. A rövid négy hónapos támogatási időszak elég volt ahhoz, hogy a 125148 project kezdeti céljait teljesítsük. Közvetlen patch clamp elvezetésekkel kimutattuk, hogy a GMFT- és sMFT AP-ja meglepően hasonlóak. Továbbá létrehoztunk egy olyan computeres szimulációt, amely lehetővé teszi a biológiai jelek izolálását olyan elvezetésekből is, ahol a mérő apparátus elkerülhetetlen hibákkal szennyezi az elvezetett jeleket. Így egy eddig megoldatlan problémára tudunk megoldással szolgálni. Harmadrészt, adaptáltunk egy új feszültség-érzékeny festékeken alapuló mérési eljárást az axon különböző pontjain történő AP mérésekhez, igazolva az új módszer megbízhatóságát.
kutatási eredmények (angolul)
The goal of this project was to better understand signaling principles of hippocampal mossy fiber axon terminals as a model for general cortical axons. Axons are less known fundamental elements within the neuronal circuit due to their difficult access for direct measurements. Specifically, the project focused on action potential (AP) signaling in the small mossy fiber terminals (sMFT) and compared them with the better known, but exceptionally large giant terminals (GMFT) of the same axons using direct patch clamp electrophysiology and voltage-sensitive dye imaging. However, the OTKA support had to be terminated because our research group won a Consolidator ERC grant, whose topic substantially overlaps with the K_17 support. The aims of K_17 project will be fully completed with the help of the ERC_CoG. Importantly, this short period was sufficient to complete the initial goals of the K_17 project. First, using direct recordings we revealed that AP shapes are similar in GMFTs and sMFTs, in spite of their different biophysics and neuronal functions. Second, we created a computer model of the recording instrument, which allows for the isolation of biological signals from distorted recordings, which is often the case with small recorded structures. Third, we adapted a new voltage-sensitive dye imaging method that allows simultaneous measurement of APs in various locations along the axons. We performed proof-of-principle experiments that proved the advantages of this novel method.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=125148
döntés eredménye
igen





 

Projekt eseményei

 
2020-08-17 15:09:47
Résztvevők változása




vissza »