 |
Nagy áteresztő képességű kísérleti módszer fejlesztése transzmembrán fehérjék szerkezetvizsgálatára
|
súgó 
nyomtatás 
|
Ezen az oldalon az NKFI Elektronikus Pályázatkezelő Rendszerében nyilvánosságra hozott projektjeit tekintheti meg.
vissza »
|
| |
Projekt adatai |
|
|
| azonosító |
125607 |
| típus |
KH |
| Vezető kutató |
Tusnády Gábor |
| magyar cím |
Nagy áteresztő képességű kísérleti módszer fejlesztése transzmembrán fehérjék szerkezetvizsgálatára |
| Angol cím |
Developing high-throughput experimental method for investigation of the structure of transmembrane proteins |
| magyar kulcsszavak |
transzmembrán fehérje, szerkezet becslés, topológia adat, nagyáteresztő képességű kísérlet |
| angol kulcsszavak |
transmembrane protein, structure prediction, toplogy data, high-throughput experiment |
| megadott besorolás |
| Bioinformatika (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma) | 90 % | | Molekuláris Biológia (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma) | 10 % | | Ortelius tudományág: Moleculáris tervezés, de novo tervezés |
|
| zsűri |
Genetika, Genomika, Bioinformatika és Rendszerbiológia |
| Kutatóhely |
Molekuláris Élettudományi Intézet (HUN-REN Természettudományi Kutatóközpont) |
| résztvevők |
Dobson László
Horváth András
Langó Tamás
Varga Julia Kornélia
|
| projekt kezdete |
2017-12-01 |
| projekt vége |
2020-12-31 |
| aktuális összeg (MFt) |
20.000 |
| FTE (kutatóév egyenérték) |
6.31 |
| állapot |
lezárult projekt |
magyar összefoglaló A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
Az elmúlt évek során sikerült kifejlesztenünk egy olyan nagyáteresztő képességű kombinált elmélet és kísérleti eljárást, amellyel egyszerre több száz transzmembrán fehérjére tudunk a szerkezetre vonatkozó kísérleti adatot előállítani, amely adatokat az általunk kifejlesztett CCTOP eljárással feldolgozva nagyon nagy pontossággal tudjuk meghatározni a transzmembrán fehérjék alacsony felbontású szerkezetét. Ez az alacsony felbontású szerkezet becslés felhasználható a transzmembrán fehérjék atomi szintű modellezésére. A kísérlet lényege, hogy a transzmembrán fehérjék extra-citoszólikus oldalon levő aminosav oldalláncait valamilyen membrán impermeábilis kémiai anyaggal nem szelektíven jelöljük, amit a sejtek lizálása, a fehérjék enzimes hasítása majd a keletkezett jelölt peptideket tisztítás után tömegspektrometriával detektálunk, a jelölés szekvenciális környezetének a meghatározásával együtt. A jelen pályázatban ezt a módszert fejlesztenénk tovább, tripszines emésztést helyettesítő proteázok, újabb kémiai reagensekkel végzett jelölési stratégiák, citoszólikus jelölési módszer kidolgozása, valamint belső sejtorganellumok, transzmembrán fehérjékben rendkívül gazdag preparátumok felhasználásával, annak érdekében, hogy minél több transzmembrán fehérje szerkezetéről gyűjtsünk minél több információt, hogy szerkezetüket a lehető legpontosabban tudjuk modellezni.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
Egy előző OTKA pályázatban kifejlesztett kombinált elméleti-kísérleti technika továbbfejlesztése a jelen pályázat célja. A kidolgozott technika lényege, hogy a sejt membránban expresszálódott transzmembrán fehérjék külső oldalán levő lizin oldalláncokat kémiailag módosítjuk egy membrán impermeábilis molekulával. A módosult lizint tartalmazó fehérjék, illetve emésztés után a peptidek, avidin oszlopon tisztíthatók, majd redukáló szerrel eluálhatók. A kidolgozott módszer segítségével több száz transzmembrán fehérjét sikerült jelölnünk, és megmutattuk, hogy az általunk kidolgozott CCTOP eljárással ezen adatokat felhasználva nagymértékben növelhető a kísérlet során jelölt transzmembrán fehérjék alacsony felbontású szerkezet meghatározásának pontossága és megbízhatósága. A kidolgozott módszer nagyon sokféleképpen továbbfejleszthető annak érdekében, hogy még több fehérjéről még több topológiai adatot nyerjünk. Ehhez elsősorban a jelenlegi eljárás két gyenge pontját kell módosítani. Ezek, hogy transzmembrán fehérjéknek csak a sejtfelszíni részéről kaphatunk információt, valamint a jelölt lizin aminosav oldalláncának módosítása miatt a proteomikai kísérletekben általánosan használt tripszin nem tudja hasítani a polipeptid láncot. Ezért a jelen pályázatban szeretnénk organellum specifikus preparálási eljárásokat használni, továbbá keresnénk olyan kémiai ágenst, amellyel hatékonyan lehet élő sejtekben más aminosav oldalláncot jelölni. A módszer további módosításával lehetőség lenne specifikusan belső oldalon jelölni a transzmembrán fehérjéket, ezáltal még több értékes adatot tudnánk nyerni, amelyekkel még pontosabban lehetne a transzmembrán fehérjék szerkezetét modellezni.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
A transzmembrán fehérjék rendkívül sokrétű biológiai feladatuk miatt meghatározó szerepet játszanak a gyógyszerek hatásának biztosításában. A jelenleg forgalomban levő gyógyszerek több mint fele valamilyen transzmembrán fehérjével hat kölcsön. Ugyanakkor ezen fehérjék szerkezetének meghatározása rendkívül idő-, energia- és pénzigényes feladat, egy emberi transzmembrán fehérje szerkezetének meghatározása röntgenkrisztallográfiával több éves munkát jelent, és több mint 2.5 millió dollárba kerül, 10%-os sikerráta mellett. Az általunk korábban kidolgozott kombinált elmélet-kísérletes technika, amellyel topológiai adatokat lehet meghatározni a transzmembrán fehérjékről és ezáltal azok szerkezetét pontosabban lehet modellezni, jelenleg egyedülálló a transzmembrán fehérjék szerkezet vizsgálatában. A módszer elméleti részében kidolgozott CCTOP eljárást a Nucleic Acids Research web szerver különszámában közöltük 2015-ben, amelyre a Google Schoolar alapján eddig 29 hivatkozást kaptunk. A módszer kísérleti része, amelyet a Scientific Reports-ban közöltünk abban egyedülálló, hogy natív körülmények között egyszerre több száz transzmembrán fehérje topológiájáról ad információt , egy rövid, akár egy hónap alatt végig vihető kísérlet során. A jelen pályázatban tervezett fejlesztések révén még több transzmembrán fehérje szerkezetét tudnák hatékonyabban modellezni.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
Az élő szervezetekben levő sejtek illetve az eukarióta sejtekben levő különböző sejtalkotó részek mind membránnal határoltak. A membránt alkotó kettős lipidréteg a víz és a vízben oldható anyagok számára átjárhatatlan, ezért ezek átjutását speciális „kapuk”, az ún. transzmembrán fehérjék biztosítják. A membránba ágyazott fehérjék rendkívül fontos szerepet játszanak a különböző biológiai folyamatokban, ugyanakkor szerkezetüket kísérletes eszközökkel rendkívül nehéz, sokszor lehetetlen meghatározni. Ezért e fehérjék elméleti szerkezet vizsgálata elsőrendű fontosságú. Jelen pályázatban egy korábbi OTKA pályázatban kidolgozott kombinált elmélet-kísérleti technikát szeretnénk továbbfejleszteni, amely fejlesztések által az eddigieknél sokkal több transzmembrán fehérje elméleti szerkezetmodellezése válna lehetővé, illetve sokkal pontosabb és megbízhatóbb modelleket lehet majd építeni.
| angol összefoglaló Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
Recently, we have developed a complex theoretical and experimental approach to gain structural information about hundreds of transmembrane proteins. The acquired data can be used in the CCTOP algorithm, developed by us, to provide accurate prediction of the low-resolution structure of transmembrane proteins that would facilitate the atomic level modeling of transmembrane proteins. The experiment begins with non-selective labeling the extra-cytosolic amino acids of transmembrane proteins with a membrane impermeable compound, followed by the lysis of the cells, proteinase digestion, and the purification of the resulting labeled peptides and detection of them by mass spectrometry together with their sequential environment. In this project, we would like to improve the described method by using other proteases than trypsin, by developing labelling strategy for applying new chemical reagents, by labelling amino acids in the cytosol rather than the extra-cytosolic side, and using membrane-bounded cell organelles and membrane preparations enriched with transmembrane proteins in order to collect more information of transmembrane proteins to model their structure as accurately as possible.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
The aim of this project is to improve a theoretical-experimental method developed during a previous OTKA project. The elaborated technique is based on the tagging of extracellular lysine residues of transmembrane proteins located in the cell membrane by a membrane impermeable molecule. The modified proteins and peptides can be purified with an avidin column and eluted with a reducing agent. With the help of this developed method we were able to chemically label hundreds of transmembrane proteins and we showed that the accuracy and reliability of low-resolution structure prediction can be highly increased by using these experimental data in the CCTOP algorithm, developed by us. The delineated method can be improved several ways in order to gain more topology data from more transmembrane proteins. To the end of this aim, the two weak points have to be modified. These are that we can get only information from transmembrane proteins located on the cell surface; and modifying the side chain of lysine residues leads to the corruption of the cleavage site of trypsin, the most commonly used protease in proteomics. Therefore, we would like to apply organelle-specific membrane preparation methods that would permit the labeling of non-cell-surface transmembrane proteins. Moreover, we would like to find chemical reagents that could be used to modify effectively other side chains of residues in living cells. Further alteration of the method would enable the labeling of cytoplasmic segments of transmembrane of proteins that results in more valuable topology data and would help modeling of transmembrane proteins more accurately.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
Transmembrane proteins participate in various processes in the cells making them excellent targets for medicines. More than half of the marketed drugs interact with transmembrane proteins. Determining the structure of transmembrane proteins consumes extreme amount of time, energy and money, especially in the case of a human protein, that would costs around 2.5 million dollars, with a success rate of only 10% if the structure is determined by X-ray crystallography. The in-house developed combined theoretical-experimental procedure that provides topological data for transmembrane proteins and using these data led to a more accurate modeling of these proteins, is unique in terms of the analysis of their structure. The CCTOP algorithm, developed as the theoretical part of the method, was published in the Web Server issue of Nucleic Acids Research in 2015 and gained 29 citations so far according to the Google Scholar. The experimental part, published in the Scientific Reports, is exceptional in terms of providing topological data of hundreds of transmembrane proteins in native environment at the same time, with a 1-month-long experimental process. The new improvements, describe in the current proposal, would help the more effective modeling of transmembrane proteins.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Cells of living organisms, as well as organelles of eukaryotic cells are bounded by membranes. These double lipid layers are impermeable to water and water-soluble compounds that could only be transferred via special “gates” called transmembrane proteins. Membrane-embedded proteins play crucial roles in various biological processes; however, the determination of their structure is extremely hard, sometimes impossible. Therefore, using theoretical approaches for the analysis of their structure is of primary importance. In this proposal, we would like to further develop a complex experimental-theoretical method elaborated during a previous OTKA project. The improvements would allow the modeling of much more transmembrane proteins with an increased accuracy and reliability.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
