 |
Investigating the mechanisms of sarcomeric thin filament assembly
|
Help 
Print 
|
Here you can view and search the projects funded by NKFI since 2004
Back »
|
| |
Details of project |
|
|
| Identifier |
128623 |
| Type |
PD |
| Principal investigator |
Szikora, Szilárd |
| Title in Hungarian |
A szarkomerikus vékony filamentumok összeszerelődésének vizsgálata |
| Title in English |
Investigating the mechanisms of sarcomeric thin filament assembly |
| Keywords in Hungarian |
szarkomer, sejtváz, nanoszkópia |
| Keywords in English |
sarcomere, cytoskeleton, nanoscopy |
| Discipline |
| Morphology and functional imaging of cells (Council of Medical and Biological Sciences) | 50 % | | Molecular biology (Council of Medical and Biological Sciences) | 25 % | | Ortelius classification: Molecular biology | | Development, developmental genetics, pattern formation and embryology (Council of Medical and Biological Sciences) | 25 % |
|
| Panel |
Cellular and Developmental Biology |
| Department or equivalent |
Institute of Genetics (HUN-REN Biological Research Centre Szeged) |
| Starting date |
2018-09-01 |
| Closing date |
2022-02-28 |
| Funding (in million HUF) |
15.807 |
| FTE (full time equivalent) |
2.80 |
| state |
closed project |
Summary in Hungarian A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
Az izomszövet fejlődése során az aktin és miozin molekulákból felépülő filamentumok, magasan szervezett kontraktilis egységekké, szarkomerekké állnak össze. Az új szarkomerek képződéséhez új aktin filamentumok, más néven vékony filamentumok kialakulása szükséges, azonban ennek a mechanizmusa nem ismert. A nem izomsejtekkel ellentétben, a szarkomerikus vékony filamentumok a hegyes (negatív) végükön növekednek, azonban hegyes vég katalizált növekedését még nem figyelték meg in vitro. A közelmúltban munkacsoportunk, néhány további laboratóriummal együtt, több fehérjét is azonosított, amelyek fontos szerepet játszanak a vékony filamentumok növekedésében, feltehetően a hegyes vég szabályozásán keresztül. Ezen mechanizmusok direkt vizualizációja és az egyes fehérjék kapcsolatának pontos megértése azonban nem lehetséges konvencionális fluoreszcens mikroszkópiával. A hagyományos optikai rendszerek felbontását a fény fizikai tulajdonságai korlátozzák (diffrakciós limit), ennek következtében, a ~250 nm-nél kisseb struktúrák direkt vizsgálata gyakorlatilag nem lehetséges. A közelmúltban kidolgoztak néhány úgynevezett szuperrezolúciós mikroszkópos módszert (a továbbiakban nanoszkópia), amellyel megkerülhető ez a szabály. Ezeket a felfedezéseket 2014-ben kémiai Nobel-díjjal jutalmazták. Csoportunk fő célkitűzése, hogy a legújabb, egyedi molekula lokalizációs mikroszkópiát felhasználva, megismerjük a szarkomerek és azon belül is a vékony filamentumok molekuláris szintű szerveződését. Bízunk benne, hogy ez az úttörő megközelítés, élősejtes vizsgálatokkal kiegészítve, jelentősen bővíteni fogja a szarkomer szerveződésről és a vékony filamentum növekedésről szerzett ismereteinket.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
A fő célkitűzésünk a szarkomer szerveződés és vékony filamentum összeszerelődés alaposabb megismerése. A szarkomer összeszerelődés számos fontos faktora ismertté vált a sejtbiológiai, genetikai és biokémiai munkáknak köszönhetően. Mivel azonban ezeknek a fehérjéknek a direkt vizualizációját gátolja a diffrakciós limit, a pontos szerveződésük nem ismert. A közelmúltban kifejlesztett nanoszkópiás módszerek azonban lehetővé teszik az egyedi szarkomereken belüli molekuláris elrendeződés vizsgálatát. Célul tűztük ki egy olyan munkafolyamat kialakítását, amely tartalmazza a mintakészítés, az adatgyűjtés és feldolgozás optimalizálását és standardizálását, annak érdekében, hogy megbízható és reprodukálható információkat szerezzünk a molekuláris lokalizációról, elsősorban a szarkomerikus vékony filamentumokat felépítő és szabályozó fehérjék kapcsán. A korábbi ismereteinkkel együtt, az újonnan megszerzett információk felhasználhatók lesznek egy nagy precizitású szarkomerikus molekulatérkép megalkotására. Vizsgálatainkat élősejtes mikroszkopiás analízissel egészítenénk ki –FRAP és egyedi molekula dinamika mérésekkel– amelyek alkalmasak lennének a megfigyeléseink megerősítésére egy független modellrendszerben.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
A molekuláris szintű struktúrák megismerése nélkülözhetetlen a vékony filamentum és szarkomer összeszerelődés megismeréséhez. Ezért az izmot felépítő fehérjék helyzetének pontos megismerése alapvető problémája a sejt és izombiológiának. A konvencionális fluoreszcens mikroszkópia feloldási határának következtében a vékony filamentumot szabályozó fehérjék pontos szerveződése nem ismert. Az úgynevezett, nanoszkópiás módszerek robbanásszerű fejlődésének következtében azonban lehetővé vált fehérje komplexek belső szerveződésének vizualizálása. Az egyedi molekula lokalizáción alapuló nanoszkópiás képalkotással a feloldási határnál jóval kisebb struktúrák is vizsgálhatóak. Részecske-átlagolással kombinálva a rendszer elérheti a molekuláris szintű felbontást. Az egyedi molekula lokalizációs mikroszkópiák hatékony használata multidiszciplináris szakértelmet kíván, így még mindig csak kevés laboratórium számára elérhető. A szakterület vezető laboratóriumai már elkészítették néhány struktúrának a nagyfeloldású modelljét, azonban ezek általában kevesebb, mint 10 fehérjét tartalmaztak. Terveink szerint, csoportunk hozzávetőleg 20 fehérjének a nagy precizitású lokalizációját fogja megvizsgálni, egy korábban ilyen módszerekkel nem tanulmányozott struktúrában. Nanoszkópiás vizsgálatainkat, élősejtes kísérletekkel és genetikai analízissel fogjuk kiegészíteni. A nagyszámú fehérje vizsgálatával a szarkomer szerveződés egy úttörő, új modelljét reméljük megalkotni. Bízunk benne, hogy az új eszközök fejlesztésével az élettudományok tágabb köréhez is hozzájárulhatunk.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
Az izomszövet megfelelő működésének alapja, az izomsejtekben lévő hosszú molekulák precíz szerveződése. Ezek a hosszú molekulák képesek erőt kifejtve elcsúszni egymáson és így izom összehúzódást generálni. Az izmok megbízható összehúzódása és elernyedése nélkülözhetetlen minden állat számára. Ez az elképesztő struktúra teszi lehetővé, hogy például a szívünk egész életünkben dolgozzon, vagy, hogy egy muslica 240-szer csapjon a szárnyaival másodpercenként. De vajon hogyan alakulnak ki ezek a rendkívüli szerkezetek? Hogy ezt a kérdést megválaszoljuk, meg kell értenünk az izomsejtek molekuláris felépítését. Genetikai és a biokémiai módszerekkel már eddig is számos információt nyertünk az izomrostok molekuláris összetevőiről. Azonban, mindezek mellett, a mikroszkopikus biológiai folyamatok láthatóvá tétele is elengedhetetlen fontosságú. Sajnálatosan a fény fizikai tulajdonságainak következtében a hagyományos fénymikroszkópok felbontása korlátozott, ahogyan azt Ernst Abbe megállapította 1873-ban. Ennek következtében pedig az izomszövetet felépítő molekulák nyomon követése lehetetlen. A közelmúltban azonban néhány kiváló kutatónak sikerült a fizika szabályait megkerülni. Felfedezésüket, az úgynevezett szuper-felbontású fluoreszcens mikroszkópiát, 2014-ben kémiai Nobel-díjjal jutalmazták. Ezeknek az új mikroszkópoknak a kifejlesztése lehetővé tette, hogy korábban nem látott struktúrákat vizsgáljunk. Csoportunk célja, hogy ezeket a forradalmi technikákat arra használjuk, hogy megértsük az izmok fejlődésének molekuláris részleteit. Ezen új ismeretek hozzájárulhatnak a különböző izomeredetű betegségek megértéséhez is.
| Summary Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
During muscle development, actin and myosin containing filaments assemble into highly organized, contractile sarcomeric structures. Although sarcomerogenesis clearly involves de novo formation of actin filaments (termed here thin-filaments), this process remained poorly understood. Unlike, in non-muscle cells, sarcomeric thin-filaments elongate from their pointed ends, however catalysed pointed end elongation has never been observed in vitro. Previously, we and others identified several candidate proteins which are involved in thin-filament elongation, presumably through regulating pointed end dynamics. Nevertheless, direct visualization of the mechanism and the relationship between these proteins is not possible with conventional fluorescence microscopy, since the resolution of optical microscopes is limited by the physical properties of light. Consequently, observations under the scale of ~250 nm are effectively impossible. Recently, a number of so-called superresolution microscopic methods have been developed to overcome this obstacle. The major aim of our current proposal is to use single molecule localization microscopy to reveal sarcomere organization at a previously unprecedented resolution level. We expect that our pioneering approach will lead to a refined model of sarcomere formation, and the second major part of this application will focus on critical testing of the predictions of the new model by combining the advanced microscopic methods with the power of genetics and live imaging of cultured myocytes. Together, these results may significantly broaden our knowledge of sarcomere organization and the mechanisms of thin filament elongation.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
Our major aim is the deeper understanding of sarcomere organization and thin filament assembly. Genetic analysis combined with biochemistry and cell biology revealed many players involved in sarcomere assembly. However, visualization of these proteins is limited by the diffraction limit, and for this reason, molecular reconstruction of these assemblies remained speculative. Application of the recently developed nanoscopic techniques could allow us to visualize molecular organization within individual sarcomeres. A fundamental cornerstone of this proposal is to optimize and standardize sample preparation, data collection and processing in order to gain reliable information on molecular localizations. In particular we would like to localize thin filament constituents and proteins involved their assembly. By integrating our comprehensive localization information with previously generated protein structure and interaction data, we plan to model sarcomeric protein assemblies with unprecedented precision and details. In addition to single molecule localization, genetic approaches and live imaging performed on cultured myocytes combined with advanced techniques - including fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and single-particle tracking (SPT) - could further confirm our observations.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
Determining the precise molecular architecture remains indispensable for understanding the process of thin filament assembly and sarcomere organization in general. Therefore, elucidating the accurate localization of the sarcomeric proteins is essential for the field of muscle biology and a fundamental problem in cell biology. Due to the resolution limit of conventional fluorescence microscopy, information about the molecular organization of thin filament regulators remained limited. However, recent development of the so-called nanoscopic imaging techniques revolutionized our ability to visualize the inner structures of protein complexes and macromolecular assemblies. Nanoscopic imaging, based on single molecule localization, provides spatial resolutions that are well below the diffraction limit and in combination with particle averaging methods, single-molecule localization microscopy can deliver localization maps of different proteins of multiprotein complexes with high precision, approaching virtually molecular resolution. The efficient use of these sophisticated methods is technically challenging and requires multidisciplinary expertise; hence it is still limited to a few laboratories worldwide. Leading laboratories of the field have already provided molecular maps of a few macromolecular assemblies containing usually less than 10 proteins. By comparison we plan to analyse ~20 proteins in a structure that has never been studied with such detail before. Furthermore we will strengthen our work by applying genetic analysis and live imaging. By covering a broad range of sarcomeric proteins we expect that we can establish a pioneering new model of sarcomere assembly. We hope that by developing new methods we can potentially contribute to other fields of cellular life sciences as well.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Proper functioning of muscle tissues depends on well-organized long molecules able to slide along each other and generate force, ultimately lading to muscle contraction. The reliable contraction and relaxation of these muscles are indispensable for every animal. This spectacular structure enables our heart to work throughout our lifetime or allow a fruit fly to beat their wings 240 times per second. How are these remarkable structures form? To answer this question we need to understand the molecular organization of muscle cells. Genetics and biochemistry have already provided us a lot of information regarding the protein molecules involved in the assembly and growth of muscle fibers. Despite these advances, direct visualization of these proteins during muscle development remained impossible. Due to the physical properties of light, the resolution of conventional light microscopy is limited, as stated by Ernst Abbe in 1873. Remarkably however, physicists were recently able to circumvent this obstacle and developed the so-called super-resolved fluorescence microscopic techniques, awarded by Nobel Prize in 2014. The development of these tools can now allow biologists to visualize previously unseen structures. Our aim is to use these revolutionary techniques to understand the molecular details of muscle development. Since heart failure is still one of the leading causes of death worldwide, deeper understanding of muscle biology remains exceptionally important.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
