Specifikus kovalens módosítások kialakítása fehérjékben  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »

 

Projekt adatai

 
azonosító
77783
típus K
Vezető kutató Tömböly Csaba
magyar cím Specifikus kovalens módosítások kialakítása fehérjékben
Angol cím Specific covalent modifications in proteins
magyar kulcsszavak peptid, fehérje, kémiai ligáció, liposzóma
angol kulcsszavak peptide, protein, chemical ligation, liposome
megadott besorolás
Szerves-, biomolekuláris- és gyógyszerkémia (Élettelen Természettudományok Kollégiuma)95 %
Ortelius tudományág: Makromolekuláris kémia
Általános biokémia és anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok)5 %
Ortelius tudományág: Sejtkémia
zsűri Kémia 2
Kutatóhely Biokémiai intézet (MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont)
résztvevők Borics Attila
Fodor Elfrieda
projekt kezdete 2009-04-01
projekt vége 2013-10-31
aktuális összeg (MFt) 19.604
FTE (kutatóév egyenérték) 2.25
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A tervezett kutatás célja a fehérjék széles körében alkalmazható, specifikus kémiai módosítások bevitelére alkalmas szintetikus módszerek kidolgozása a prion fehérje (PrP), mint modell rendszer felhasználásával. A PrP sejtmembrán integrációját biztosító, fluoreszcens jelzett, koleszterin alapú membrán horgony mimetikumokat állítunk elő, majd rekombináns PrP fehérjét konjugálunk hozzá. A kapott konjugátum a PrP in vitro és in vivo körülmények közötti vizsgálatában kerül felhasználásra. Ezt követően a prion fehérje totálszintézisére olyan konszekutív kémiai ligáción alapuló módszert dolgozunk ki, amely lehetővé teszi a natív szekvencia tetszőleges pozicióban történő szelektív módosítását.
angol összefoglaló
The project targets a synthetic method with which site-specific covalent modifications can be incorporated into proteins. The model system is the prion protein (PrP), where the chemical synthesis of fluorescent labeled membrane anchor molecules and the total chemical synthesis of the full length PrP will be performed. The anchor mimetic will be used for conjugation to recombinant PrP, and this semisynthetic derivative will be used for in vitro and in vivo studies of the PrP misfolding, the basic phenomenon during prion pathogenesis. The total synthesis of PrP will be performed in a consecutive manner, and the successful assembling of the PrP from seven fragments will give a flexible frame to incorporate any site-specific covalent modification to any residue.





 

Zárójelentés

 
kutatási eredmények (magyarul)
Félszintetikus stratégiát dolgoztunk ki fehérjék fluoreszcens koleszterin származékokkal történő módosítására. A szükséges koleszteril horgony molekulákat konvergens úton állítottuk elő, így a fejcsoportban található Michael akceptor, fluorofór és távtartó mind az adott kísérleti elrendezéshez hangolhatók. Kísérletesen igazoltuk a horgonymolekulák élő sejtek membránjához történő asszociációját, valamint molekuladinamikai számításokkal támasztottuk alá a fejcsoport extracelluláris irányultságát. A sejtmembránhoz horgonyzás stratégiáját a piros fluoreszcens mCherry fehérje koleszteril származékán keresztül mutattuk be. Ebben az esetben az egyik fluorofór a lipid fejcsoportban helyezkedik el, így egyértelműen igazolni tudtuk a lipoprotein származék homogenitását és tisztaságát. A prion fehérje analóg koleszteril származékait is előállítottuk. β-ciklodextrin zárványkomplex alkalmazásával elértük, hogy a fehérjék natív térszerkezete megmaradjon a koleszteril horgony konjugációja után is. A koleszteril lipoprotein zárványkomplexekkel kezelt élő sejtek membránjába nem került zavaró detergens vagy fölösleges fluoreszcens lipid, így a lipoprotein exogén membránba juttatását követően a membránhoz asszociálódott fehérje közvetlenül leképezhető volt a lipid fejcsoport fluoreszcenciája segítségével. Az így kidolgozott kismolekulájú fluorofór alkalmazásán alapuló membránfehérje vizsgálati módszer hasznos alternatívája lehet a GFP fúzión alapuló megközelítéseknek.
kutatási eredmények (angolul)
A semisynthetic strategy was developed for the modification of proteins with fluorescent cholesterol derivatives. The appropriate cholesterol anchors were synthesized with a convergent strategy that allowed flexibility in the molecular design of the head group, i.e. the Michael acceptor, the PEG spacer length and the fluorescent reporter all can be fine-tuned to the preferences of the particular application. The membrane association of the cholesterol anchors was confirmed experimentally, and an extracellular orientation of the headgroup was shown by molecular dynamics simulations. The membrane anchoring method was demonstrated on the red fluorescent protein mCherry that was conjugated with a green fluorescent anchor. Due to the presence and position of the green fluorescent reporter, the purity and the homogeneity of the cholesteryl lipoprotein could be unambiguously analyzed. Most importantly the modification of mCherry and the full length PrP with fluorescent cholesterol derivatives was achieved without denaturing the protein fold. The application of β-cyclodextrin inclusion complexes allowed a treatment of live cells with the cholesteryl lipoproteins without the introduction of membrane perturbing surplus lipids or detergents. After exogenous introduction, direct imaging of membrane anchored proteins became feasible with a small molecule fluorophore, thus our strategy offers a beneficial alternative to GFP fusions for studying membrane associated proteins.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=77783
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

 
Schäfer B; Fodor E; Welker E; Tömböly Cs: Synthesis of a glycosylphosphatidylinositol mimetic for prion protein anchoring., Joint meeting on medicinal chemistry, Budapest, 2009. június 24-27., 2009
Bojnik E; Farkas J; Magyar A; Tömböly Cs; Güclü Ü; Gündüz Ö; Borsodi A; Corbani M; Benyhe S: Selective and high affinity labeling of neuronal and recombinant nociceptin receptors with the hexapeptide radioprobe [3H]Ac-RYYRIK-ol, Neurochem Int, 2009
Tömböly Csaba, Majer Mariann, Kele Zoltán, Welker Ervin: Lépésenkénti kémiai ligációs módszer fejlesztése félszintetikus fehérjék előállitásához, MKE vegyészkonferencia, Hajdúszoboszló, 2010. június 30-július 2., 2010
Schäfer Balázs, Kele Zoltán, Welker Ervin, Tömböly Csaba: Glikozil-foszfatidil-inozitol horgonyt utánzó molekulák szintézise, MKE vegyészkonferencia, Hajdúszoboszló, 2010. június 30-július 2., 2010
Majer Mariann, Kele Zoltán, Welker Ervin, Tömböly Csaba: Konszekutiv nativ kémiai ligáció enzimatikus lépésének vizsgálata, MKE vegyészkonferencia, Hajdúszoboszló, 2010. június 30-július 2., 2010
Petrovszki Z., Kovács Gy., Kékesi G., Tömböly Cs., Benedek Gy., Horváth Gy.: Effects of peptide and lipid endocannabinoids on arthritic pain at spinal level, Anesthesia & Analgesia, 2012
Welker E., Tömböly Cs.: N-terminális metionil-metionin szekvencia alkalmazása rekombináns fehérjék enzimatikusan, mutáns metionil-aminopeptidázzal eltávolítható védőcsoportjaként natív kémiai li, P1100474, 2011
Welker E., Tömböly Cs.: Metionin – metionil-aminopeptidáz rendszer alkalmazása szilárd fázisú peptid szintézissel készült, N-terminális ciszteint tartalmazó peptidek N-Cys amino csoportjának véd, P1100475, 2011
Balázs Schäfer, Mariann Majer, Ervin Welker, Csaba Tömböly: Prion protein modification with chemical methods, 4th ECCLS, Budapest, előadás, 2011
Schäfer B., Orbán E., Borics A., Huszár K., Nyeste A., Welker E., Tömböly Cs.: Preparation of Semisynthetic Lipoproteins with Fluorescent Cholesterol Anchor and their Introduction to the Cell Membrane with Minimal Disruption of the Membrane, Bioconj. Chem., 2013




vissza »